促凋亡蛋白Bim、Bax和Bak在牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中的表达

目的建立牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡模型，检测成骨细胞凋亡过程中与Bc｜-2蛋白相互作用的细胞死亡调解子（Bcl-2 interacting mediator，Bim）、Bcl-2蛋白相关X蛋白（Bcl-2associated X protein，Bax）和Bcl-2蛋白拮抗剂（Bcl-2 antagonist／killer，Bak）的表达，探寻保护成骨细胞的方法，为牙周炎的发病机制研究提供依据。方法提取牙龈蛋白酶并测定其活性；将0．453、0．906、1．812U／L牙龈蛋白酶分别与成骨细胞共培养0、16、24和48h，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色及膜联蛋白V-碘化丙啶双染色检测牙龈蛋白酶诱导成骨细胞（小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14）凋亡，建立牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡模型；1．812U／L牙龈蛋白酶与成骨细胞共培养0、4、8、16、24和48h，蛋白质印迹法确定成骨细胞凋亡过程中Bim、Bax、Bak的蛋白表达；胰蛋白酶抑制剂抑制1．812U／L牙龈蛋白酶活性后与成骨细胞共培养24h，蛋白质印迹法检测Bim蛋白表达与成骨细胞凋亡率的改变。结果精氨酸-牙龈蛋白酶活性为（18．11±2．11）U／L，赖氨酸-牙龈蛋白酶活性为（1．02±0．25）U／L；DAPI染色显示1．812U／L牙龈蛋白酶可诱导成骨细胞凋亡，16h凋亡率为（6．31±0．37）％，24h达（11．20±0．35）％，48h为（10．80±0．46）％；膜联蛋白V-碘化丙啶染色结果与DAPI染色结果基本-致。成骨细胞凋亡过程伴随促凋亡蛋白Bim的表达升高，4h时Bim相对蛋白表达量为（0．31±0．03），约为对照组（0．17±0．03）的2倍，24h时Bim相对蛋白达峰值（0．57±0．05），为对照组的3～4倍；胰蛋白酶抑制剂可有效抑制牙龈蛋白酶活性，使Bim蛋白表达量由（0．58±0．04）降至（0．14±0．03）；同时DAPI染色显示胰蛋白酶抑制剂可逆转牙龈蛋白酶诱导的细胞凋亡，24h成骨细胞凋亡率由（11．20±0．35）％降至（4．31±0．38）％。成骨细胞高表达Bax（相对蛋白表达量为0．85±0．05），在成骨细胞凋亡过程中，Bax的相埘蛋白表达总量无明显改变；蛋白质印迹法未检测到成骨细胞表达Bak。结论1．812U／L牙龈蛋向酶可诱导成骨细胞凋亡，凋亡过程中伴随Bim表达升高．抑制牙龈蛋白酶活性可有效降低Bim的蛋白表达，提示促凋亡蛋白Bim参与牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡过程，抑制Bim的表达可使成骨细胞免于凋亡。

牙龈卟啉单胞菌的fimA分型及其与细菌致病力的关系

牙周炎是一种由病原微生物引起的发生在牙齿支持组织的慢性感染性疾病,菌斑细菌是牙周炎发生的始动因子.牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）是公认的牙周主要致病菌之一,fimA分型是Pg各种分型方法中的一种,自Pg的fimA分型提出后,对不同fimA基因型Pg的研究一直是牙周病病因学研究的热点之一,现就Pg的fimA分型及其与细菌致病力的关系做一综述.

表达双色荧光蛋白的RAW264.7单克隆细胞株的构建及鉴定

目的 利用慢病毒载体（pVSVG）构建表达双色荧光蛋白的单克隆RAW264.7细胞株及其功能鉴定,以期实时检测它们在破骨细胞形成过程中的表达及动态变化.方法 利用pVSVG构建表达双色荧光蛋白的单克隆RAW264.7细胞株,采用激光扫描共聚焦显微镜活细胞成像技术连续动态观察RAW264.7细胞在NF-κB受体激活蛋白配体诱导下向破骨细胞形成的过程.采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色（tartrate-resistant acid phosphatase staining,TRAP）及4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色对表达磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）与超正电荷的RAW264.7细胞株及破骨细胞进行功能鉴定.结果 联合转染的RAW264.7细胞株形态为圆形或椭圆形,为正常生长形态,且保留了良好的破骨细胞分化能力.超正电荷绿色荧光蛋白（＋ 8-greenfluorescent protein,＋8-GFP）主要表达在RAW细胞的质膜上,分布均匀;当破骨细胞形成后,＋8-GFP在质膜上的荧光强度明显减弱;PS表达在RAW细胞的质膜上,但在破骨细胞形成后,PS不仅表达在质膜上,同时也分布在细胞质和细胞器上.活细胞成像观察发现破骨细胞融合可发生在贴壁状态下及单核与单核、单核与多核及多核与多核细胞之间,最终形成巨大的多核破骨细胞,因此破骨细胞的融合具有反复性.结论 成功构建可同时表达双色荧光蛋白的单克隆细胞株,为在三维空间进一步研究膜融合过程中的各种蛋白质和其他分子的构象改变,以及它们之间的相互作用方式提供了平台.