人DNA拓扑异构酶Ⅰ在毕赤酵母中的表达及发酵条件优化

为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ (hTopoⅠ )为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选 ,用RT PCR法从Hela细胞中克隆了hTopoⅠ基因ORF并在毕赤酵母中首次成功表达 ,表达产物可分泌到发酵上清 ,易于制备。蛋白酶A缺陷的重组酵母 (SMD hTopoI)分泌重组酶的能力比具有蛋白酶A活性的重组酵母 (X3 3 hTopoI和KM hTopoI)更高。通过发酵条件的优化 ,使用BMMY(pH 7 2 5) ,于 2 0℃ ,每隔 2 4h补加 0 5% (V V)的甲醇和 3 % (V V)的营养液 ,SMD hTopoⅠ诱导 72h后可表达最高的酶活力 (43 0 0 0u mL) ,发酵上清中hTopoⅠ可达 11mg L ,约占总蛋白的 10 %。SDS PAGE和Westernblot分析显示 ,表达的hTopoⅠ为 91kD蛋白 。