霉酚酸衍生物对小鼠T细胞免疫功能的抑制作用

目的研究2种新型霉酚酸衍生物(代号JU95-07B、JU100-07E)在体外对小鼠T细胞免疫功能的影响。方法小鼠脾细胞用抗CD3单克隆抗体(mAb)刺激,同时加入不同浓度(10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L)及在不同时间点(刺激细胞后第0、6、12 h)加入同一浓度(10-5mol/L)的霉酚酸衍生物后,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清中IFN-γ和IL-2的水平。同时利用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测霉酚酸衍生物对T细胞IFN-γ和IL-2的分泌、表面分子CD25的表达以及增殖的影响。结果 2种霉酚酸衍生物对抗CD3刺激条件下诱导的小鼠脾细胞产生的IFN-γ和IL-2均具有浓度依赖性抑制作用,并且在抗CD3刺激的不同时间点分别加入2种霉酚酸衍生物均能不同程度地抑制小鼠脾细胞产生IFN-γ和IL-2;同时,与单独使用抗CD3刺激相比,分别加入10-5mol/L浓度的2种霉酚酸衍生物后,均能抑制小鼠T细胞表面分子CD25的表达以及增殖。结论体外实验表明2种霉酚酸衍生物均对小鼠T细胞免疫功能具有明显抑制作用,该研究提示这2种霉酚酸衍生物可以抑制自身免疫性疾病和移植排斥反应。

IL-12有助于化疗药物处理后肿瘤患者及小鼠的细胞免疫功能重建

目的探讨白细胞介素12(IL-12)是否能够恢复化疗药物对肿瘤患者和小鼠细胞的免疫抑制作用。方法分离顺铂化疗前后肿瘤患者及正常人外周血单个核细胞(PBMC),在抗CD3抗体和抗CD28抗体共刺激条件下,加或不加IL-12。培养后,ELISA检测上清中γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平,流式细胞术检测不同亚群T细胞IFN-γ的水平。建立顺铂毒性小鼠模型,采用以上方法检测IFN-γ、TNF-α水平。结果肿瘤患者产生的IFN-γ和TNF-α显著低于正常人;与化疗前患者相比,化疗后患者IFN-γ和TNF-α的产生明显减少,IL-12可以显著增强IFN-γ和TNF-α的产生;T细胞亚群分析的结果表明,IL-12可以恢复化疗后CD4^+T细胞和CD8^+T细胞中IFN-γ的水平。小鼠体内实验证明,化疗药物抑制小鼠T细胞的免疫功能,IL-12能完全恢复T细胞免疫功能。结论化疗药物抑制肿瘤患者和小鼠细胞的免疫应答,而IL-12能够恢复化疗药物对细胞因子的抑制作用,从而对肿瘤化疗患者重建免疫功能起到非常重要的作用。

子宫组织定居记忆T细胞的免疫学特征

目的探究小鼠子宫内组织定居记忆T细胞(Trm)的分布、表型和功能等免疫学特性。方法 Balb/c小鼠经心脏灌洗去除循环中的记忆T细胞后,用胶原酶和DNaseⅠ消化得到子宫中淋巴细胞,脾组织研磨后得到单细胞悬液,用流式细胞术检测子宫和脾组织中组织定居记忆T细胞的表型特征;用多克隆刺激剂刺激后,流式检测IFN-γ的表达。结果小鼠子宫和脾脏中T淋巴细胞表达Trm的表面分子标志CD69和CD103,子宫中T细胞表达CD69和CD103高于脾组织中T细胞。且发现CD69^+T细胞比CD69-T细胞表达较高水平的IFN-γ。而CD103-T细胞比CD103^+T细胞表达较高水平的IFN-γ。CD69^+CD103^+和CD69^+CD103-的Trm细胞表达记忆细胞表面分子CD44的比例高于CD69-CD103-和CD69-CD103^+非Trm细胞。结论小鼠子宫中存在着一群Trm细胞,其表面表达CD69和/或CD103。CD69^+T细胞比CD69-T细胞产生较高的IFN-γ,而CD103-T细胞比CD103^+T细胞产生较高IFN-γ。

结核性胸液中NK细胞的亚群及表型功能特征分析

目的探讨结核性胸液(PFC)中NK细胞的亚群分布及表型功能特征。方法以正常人外周血单个核细胞(PBMC)作对照,利用多种标记抗体进行表面和细胞内细胞毒效应分子染色,再利用流式细胞仪在单个细胞水平上分析结核性胸水中NK细胞亚群的异质性和生物学特征。结果 NK细胞可以分为CD56+CD16-、CD56+CD16+和CD56-CD16+三个亚群,与PBMC中的NK细胞相比,PFC中CD56+CD16-NK细胞亚群明显增加,而CD56+CD16+NK细胞亚群比例明显下降;结核性胸液中CD56+CD16-及CD56+CD16+NK细胞亚群表达较低水平的颗粒酶B,CD107a/b的比例在结核性胸液中3个NK细胞亚群中均有增加(P<0.05)。结核性胸液中NK细胞表达高水平表面抑制性受体NKG2A及表面活化性受体NKG2D。活化分子CD69及CD25在结核性胸水中NK细胞上的表达均有所增加(P<0.05)。结论结核性胸液中的NK细胞比例与PBMC相比发生变化,结核性胸液中的NK细胞表达低水平杀伤分子颗粒酶B但表达高水平活化分子CD69,提示NK细胞在结核感染中发挥其生物学功能。

IL-12依赖于TRAIL途径增强NK细胞对Jurkat细胞的杀伤功能

目的:探讨IL-12增强正常人NK细胞对Jurkat细胞杀伤功能的相关机制。方法:纯化正常人NK细胞,分为加或不加IL-12两个刺激组,通过基因芯片筛选差异基因,并通过流式细胞术在单个细胞水平检测相关杀伤分子的表达。结果:基因芯片系统结果显示IL-12刺激组和未刺激组相比,17种基因具有显著性差异(fold change≥10),其中5种基因上调,12种基因下调。在IL-12的刺激作用下,TRAIL的表达在CD56+CD16+和CD56-CD16+NK细胞上显著增加。同时,Jurkat细胞亦高表达TRAIL受体TRAIL-R2(DR5)。TRAIL中和抗体RIK-2可以阻断IL-12诱导的NK细胞对Jurkat细胞的杀伤功能。结论:TRAIL是IL-12增强正常人NK细胞对Jurkat细胞杀伤功能的主要途径之一。

多色流式细胞术检测人外周血BCG特异性效应型记忆γδT细胞的表型特征

目的检测卡介苗(BCG)刺激后,PPD+正常人外周血中分泌IFN-γ的TCRγδ亚群及其表型特征。方法分离PPD+正常人外周血单个核细胞(PBMCs),用多色流式细胞术检测TCRγδ亚群;BCG刺激PBMCs后检测γδT细胞IFN-γ分泌水平,并分析BCG特异性γδT细胞表型特征。结果依据PBMCs中TCRγδ和δ2的表达,可将γδT细胞分为3个亚群,即δ2high、δ2low和TCRγδ中非δ2T细胞(non-δ2-γδT)细胞。其中,δ2high和δ2lowT细胞几乎全部(>98%)为CD45RO+,而non-δ2-γδT细胞中只有少部分表达CD45RO,其余大部分不表达CD45RO。δ2high和δ2lowT细胞表型类似,主要为CD45RO+CD62L-CD27-,而non-δ2CD45RO+细胞主要为CD62L-CD27+,non-δ2CD45RO-细胞几乎全部为CD62L-CD27-。BCG刺激PBMCs后,可诱导γδT细胞分泌IFN-γ,且主要为δ2high和δ2low细胞,而non-δ2-γδT几乎不产生IFN-γ。进一步分析BCG特异性γδT细胞的表型特征,结果表明,δ2high-CD45RO+IFN-γ+和δ2lowCD45RO+IFN-γ+细胞主要为CD62L-CD27-和CD62L-CD27+,为效应型记忆细胞。结论 BCG刺激PPD+正常人外周血PBMCs后,主要诱导δ2T细胞分泌IFN-γ,且该细胞表现出CD45RO+CD62L-效应型记忆细胞特征,可能在预防结核早期感染中发挥重要作用。

八色流式细胞术检测人外周血BCG特异性效应型记忆CD4^+ T细胞的表型特征

目的:检测BCG刺激后,PPD+正常人外周血中细胞因子产生及其亚群。方法:分离PPD+正常人外周血单个核细胞(PBMC),BCG刺激后检测CD4+和CD8+ T细胞细胞因子分泌,并用八色流式细胞术分析BCG特异性T细胞亚群。结果:BCG刺激PBMC后,主要是CD4+T细胞分泌Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2和TNF-α),而CD8+T细胞几乎不产生细胞因子。进一步分析分泌细胞因子的细胞亚群,主要是CD4+CD45RO+CD62L-CD27-和CD4+CD45RO+CD62L-CD27+分泌细胞因子。结论:BCG刺激PPD+正常人外周血PBMC后,主要诱导CD4+ T细胞分泌细胞因子,且该细胞表现出CD4+CD45RO+CD62L-效应型记忆细胞特征,可能在预防结核感染中发挥重要作用。

人扁桃体和外周血中B细胞亚群、表型和功能的比较

目的比较观察人扁桃体和外周血中B细胞的亚群分布、表型及功能特征。方法分离人扁桃体单个核细胞和外周血PBMCs,流式细胞术检测其B细胞表面分子的表达;将人扁桃体单个核细胞和外周血PBMCs进行体外培养后,ELISA法检测培养上清中免疫球蛋白(Ig)含量。结果流式细胞术检测结果表明,与PBMCs中B细胞亚群不同,扁桃体单个核细胞中含有较高比例的生发中心细胞(GC cells),且初始B细胞(naive B cells)比例较低。与PBMCs相比,扁桃体单个核细胞中CD19+CD38highCD20+/-浆细胞的比例较高,但两者B细胞表面IgM和IgG表达的差异并不显著(P>0.05)。扁桃体B细胞上表达CD69的水平明显高于PBMCs中B细胞,而CD25在扁桃体及PBMCs中B细胞上均不表达或表达甚微。ELISA检测结果表明,未经刺激的扁桃体单个核细胞产生IgG的含量高于PBMCs,IgA和IgM含量与PBMCs相比,差异不显著。结论人扁桃体和外周血中B细胞亚群分布及功能特征均存在一定差别,为进一步研究B细胞如何在淋巴组织中发挥免疫功能提供了实验依据。

人肠道正常粘膜组织与外周血中记忆性IL-22^+T淋巴细胞频率及表型的比较

目的比较人肠道正常粘膜组织与外周血中IL-22+T淋巴细胞的频率及其表型特征。方法分离人肠道正常粘膜与外周血中单个核细胞,anti-CD3+anti-CD28刺激后,采用流式细胞术(FACS)检测IL-22的产生及其与IFN-γ、IL-17的关系,分析IL-22+T淋巴细胞CD45RO,CD62L,CCR7,CCR6,CCR10,CCR4等表面分子的表达。结果与anti-CD3+anti-CD28刺激外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞产生少量的IL-22(0.6%;0.57%)相比,肠道粘膜CD4+T细胞产生大约3.15%的IL-22,CD8+T淋巴细胞产生4%左右的IL-22。此外,肠道粘膜CD4+和CD8+T细胞中存在一群产生IL-22并独立于Th1、Th17,Tc1、Tc17的细胞亚群。肠道粘膜IL-22+T细胞表达较高比例的CD45RO,其中部分细胞表达CCR7,而较少表达CD62L。进一步研究表明,肠道粘膜CD4+IL-22+和CD8+IL-22+T细胞表达较高水平的CCR10(55.3%;73.9%),部分细胞表达CCR6或CCR4。结论人肠道正常粘膜组织中IL-22主要由效应型或中央型记忆T细胞产生,部分IL-22+T细胞独立于Th1、Th17,Tc1、Tc17细胞亚群。

结核性胸液中NK细胞的活化、记忆表型及分泌IFN-γ功能的多色流式分析

目的探讨结核性胸液细胞(pleural fluid cells,PFCs)中NK细胞的活化标志、记忆相关表型、NK细胞表面受体表达以及分泌细胞因子IFN-γ的情况。方法以正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)作对照,应用多色流式细胞术分析结核性胸液中NK细胞活化及记忆相关表面分子的表达情况,同时分析在细胞因子IL-12的作用下结核性胸液中NK细胞分泌IFN-γ的情况。结果与PBMCs中的NK细胞相比,PFCs中的NK细胞表达高水平早期活化标志CD69,并表达T细胞记忆相关分子CD45RO。进一步分析NK细胞的记忆相关表型,约50%的CD45RO^+NK细胞同时表达CD27,而几乎99%的CD45RO^+NK细胞不表达CD62L。PFCs中约7.3%的NK细胞同时表达CD45RO和NKG2D,约2.4%的NK细胞同时表达CD45RO和NKG2A。NK细胞功能实验提示在细胞因子IL-12的作用下,CD45RO^+NK细胞分泌更高水平的IFN-γ。结论结核性胸液中NK细胞具有记忆细胞的表型特征,表现出CD45RO^+CD27^+CD62L-效应型记忆细胞特征,在IL-12因子刺激下,CD45RO^+NK细胞产生更高水平的IFN-γ,可能在预防结核感染中发挥重要作用。

结核胸液中结核抗原刺激后CD4^+T细胞克隆性分析

目的检测结核抗原刺激后结核性胸膜炎病人胸液细胞中CD4+T细胞受体的表达情况,了解CD4+T细胞在结核局部细胞免疫应答中的作用。方法分离结核性胸膜炎病人胸液细胞(PFCs),对比BCG和结核特异性抗原(ESAT-6/CFP10混合单肽)刺激前后CD4+T细胞受体表达特征,并对刺激后部分PCR产物序列进行分析。结果 3例结核性胸膜炎患者胸液细胞未经任何刺激的条件下分别表达17~21个TCR Vβ亚家族,各存在1~2个Vβ亚家族呈现寡克隆增殖趋势。经BCG或ESAT-6/CFP10混合单肽刺激后,患者均出现4~5个寡克隆Vβ亚家族。不同患者选择性刺激的Vβ亚家族不同。结论 BCG和ESAT-6/CFP10混合单肽可分别诱导结核性胸膜炎患者不同TCR Vβ亚家族细胞寡克隆增殖,此优势表达的克隆性T细胞可能与不同结核抗原介导的特异性细胞免疫反应有关。

重组人IL-12和SCF促进新生儿脐带血中CD34^+细胞的分裂增殖

目的分析IL-12及SCF对CD34+细胞分裂增殖及IL-12Rβ的表达。方法分离正常足月产新生儿脐带血与健康成年人外周血中的单个核细胞,采用流式细胞术(FACS)比较2组中CD34+细胞的频率,分析IL-12及SCF对CD34+细胞的作用。结果健康成年人外周血中CD34+细胞平均频率为0.13%,显著低于新生儿脐带血中CD34+细胞的平均频率1.53%(P<0.001)。进一步研究表明,SCF可以促进CD34+细胞表达CD25;IL-12及SCF可以显著促进CD34+细胞的分裂增殖以及IL-12Rβ1的表达。结论新生儿脐带血中CD34+细胞的频率明显高于成年人外周血中CD34+细胞的频率。IL-12及SCF可以促进CD34+细胞的分裂增殖以及IL-12Rβ1的表达。

人外周血中HMBPP特异性Vδ2T细胞细胞因子的产生和表型特征分析

目的研究人外周血单个核细胞中HMBPP特异性Vδ2 T细胞细胞因子的产生和表型特征。方法分离人外周血单个核细胞(PBMCs)和Vδ2 T细胞,用不同剂量的HMBPP和抗人CD28联合刺激培养不同的时间。用酶联免疫吸附法和酶联免疫斑点法检测IFN-γ、TNF-α和IL-2的产生,利用流式细胞术检测Vδ2 T细胞中IFN-γ、TNF-α和IL-2的百分比及表型特征。结果 HMBPP以剂量依赖和时间依赖的方式刺激PBMCs产生IFN-γ。流式细胞术从单个细胞水平证实PBMCs中有(2.27±0.50)%CD3+T细胞表达Vδ2,HMBPP特异性刺激Vδ2 T细胞表达IFN-γ[(38.84±2.62)%]和TNF-α[(26.65±2.05)%],其中(19.43±2.10)%Vδ2 T细胞共表达IFN-γ和TNF-α。表型分析显示,HMBPP特异性Vδ2 T细胞主要为效应型和中央型记忆细胞的表型特征,即CD45RO+CCR7+/-CD62L-。HMBPP刺激纯化的γδT细胞获得相同的结果。结论 HMBPP特异性诱导人PBMCs中Vδ2 T细胞产生细胞因子IFN-γ和TNF-α,表现为记忆细胞的表型特征,本研究为探究感染和炎症性疾病中Vδ2 T细胞的功能和免疫学特征提供了依据。

洋地黄毒苷通过调控转录因子RORγt的表达抑制Th17细胞产生IL-17A

目的研究洋地黄毒苷(Digitoxin)在体外对人CD4+T细胞产生IL-17A和IFN-γ的影响及其机制。方法人PBMC用抗CD3和抗CD28抗体共刺激或在诱导Th17分化的条件下,同时加或不加Digitoxin,用酶联免疫吸附法检测培养上清中IL-17A和IFN-γ的产生。利用流式细胞术检测细胞因子IL-17A、IFN-γ以及转录因子RORγt的表达。利用Western blotting检测Digitoxin对RORγt表达的影响。结果 Digitoxin对人IL-17A有显著的剂量依赖性抑制作用,并且在刺激的早期(第0小时和第6小时)加入Digitoxin能显著地抑制IL-17A的产生,但不影响IFN-γ的产生,而晚期(第12小时和第24小时)加入Digitoxin对IL-17A的产生没有明显地抑制作用。进一步研究发现,Digitoxin抑制Th17细胞的分化,调控IL-17A的转录因子RORγt的表达。结论本实验表明,Digitoxin通过早期调控RORγt的表达来抑制IL-17A的产生,但不抑制IFN-γ的产生,提示Digitoxin除了对心血管作用外,也可以抑制炎症性疾病和自身免疫性疾病的发生发展。

鼻息肉组织和外周血中B细胞亚群和表型功能特征比较分析

目的比较鼻息肉组织和外周血中B细胞的亚群分布、表型及功能特征。方法分离鼻息肉组织浸润的单个核细胞和病人外周血PBMCs,流式细胞术分析其B细胞表面分子的表达;体外培养10 d后,ELISA法检测培养上清中免疫球蛋白(Ig)含量。结果鼻息肉浸润单个核细胞与外周血PBMCs相比,CD19+B细胞的比例无显著变化,但CD19+CD38highCD20+/-浆细胞的比例明显升高(P<0.05)。分析B细胞亚群表明,与PBMCs中B细胞相比,鼻息肉浸润B细胞中含有较高比例的记忆性B细胞和生发中心细胞,初始B细胞比例则较低(P<0.05)。鼻息肉浸润B细胞大都处于活化状态,CD69的水平明显高于PBMCs中B细胞。与PBMCs中B细胞相比,鼻息肉浸润B细胞表面IgG表达显著升高而IgM表达明显降低(P<0.05)。ELISA检测结果表明,未经刺激的鼻息肉浸润单个核细胞产生IgG、IgA和IgM含量与PBMCs相比均显著增加(P<0.05)。结论鼻息肉组织和外周血中B细胞亚群分布及功能特征均存在一定差别,本实验为进一步研究B细胞在鼻息肉病理机制中的作用提供了初步的实验依据。

托法替尼对HMBPP特异性γδT细胞功能影响的研究

目的 研究类风湿性关节炎治疗药物托法替尼对抗原特异性 γδT细胞的抑制作用.方法 选用4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸盐(4-hydroxy-3-methyl-2-butenyl pyrophosphate,HMBPP)作为抗原刺激人 γδT细胞,利用流式细胞术和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测托法替尼对HMBPP特异性 γδT细胞细胞因子产生、细胞活化、细胞增殖及转录因子磷酸化的影响.结果HMBPP可刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中 γδT细胞产生干扰素(interferon,IFN)-γ及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α,IFN-γ 的产生呈时间剂量依赖性,TNF-α在12 h达到高峰.向培养体系中加入药物托法替尼后,γδT细胞IFN-γ、TNF-α的产生显著降低.流式细胞术分析的结果表明,HMBPP刺激PBMCs后,主要为Vδ2+γδT细胞产生IFN-γ 和TNF-α.且托法替尼还可以抑制HMBPP诱导的Vδ2+γδT细胞活化,抑制CD25表达,Vδ2+γδT细胞中CD25阳性比例在第一天及第三天分别由3.85%、5.37%降至1.66%、1.70%,而不抑制CD69表达.托法替尼还可以抑制HMBPP诱导的Vδ2+γδT细胞增殖,细胞分裂比例从16.1%降至8.06%.此外,研究其机制表明托法替尼抑制HMBPP诱导的Vδ2+γδT细胞中信号传导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)1和4分子磷酸化,抑制细胞因子的产生和功能.结论 托法替尼抑制HMBPP特异性 γδT细胞细胞因子产生、细胞活化、细胞增殖及转录因子磷酸化.提示托法替尼除抑制Th1细胞的功能外,还可抑制γδT细胞的功能,为其临床应用提供理论基础.

辅助性T细胞可塑性及其分化的调控机制

辅助性CD4^+T细胞是适应性免疫应答的主要淋巴细胞。继人们首次在小鼠体内发现并命名Th1和Th2后,近20多年来又陆续发现了其他功能的Th细胞亚群,包括Th9、Th17、Th22、Tfh和Treg细胞等。关于新型Th细胞亚群的表型特征、免疫学功能和分化机制的研究成为近几年的热点,特别是Th细胞可塑性概念的提出,使得Th细胞的多功能性、相互作用和分化调控机制更加复杂化。现将总结分析国内外关于Th9、Th17、Tfh和Th22细胞的最新研究成果,论述辅助性T细胞的功能、分化的可塑性及其机制。