人外周血NK细胞亚群、表型和生物学特征

目的:探讨人外周血NK细胞的异质性和生物学特征。方法:利用多种标记抗体进行细胞表面和细胞内细胞毒效应分子染色,再利用流式细胞仪在单个细胞水平上分析NK细胞亚群的多样性和生物学特征。结果:NK细胞可分为CD56+、CD56+CD16+和CD16+三个亚群。所有CD56+NK细胞均表达CD95,但表达水平的高(CD95bright)和低(CD95dim)不同。在CD95bright和CD8+细胞亚群中有43.5%的细胞同时表达颗粒酶B和穿孔素。而CD56+CD16+和CD16+细胞表达CD95均为CD95bright,同时表达颗粒酶B(83.6%)和穿孔素(89.8%)。结论:NK细胞乃异质性群体,随着CD56表达减少和CD16表达增加,其生物效应功能逐渐成熟。

PIKA佐剂在体内外诱导小鼠免疫应答的探讨

目的探讨PIKA佐剂在体内外诱导小鼠的免疫应答。方法体外将小鼠脾淋巴细胞与不同浓度PIKA佐剂培养后,ELISA检测细胞因子IFN-γ、IL-12p40的产生,FACS检测细胞的增殖及活化。体内将PIKA佐剂经小鼠腹腔注射后,检测不同时间点血清中IFN-γ、IL-12p40、IL-6、TNF-α等细胞因子的产生。结果PIKA佐剂体外呈剂量依赖性诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ和IL-12p40。细胞亚群分析的结果表明,PIKA可显著刺激B细胞和NK细胞活化、增殖。体内注射PIKA佐剂后可诱导细胞因子IFN-γ、IL-12p40、IL-6、TNF-α的产生,但产生的时间点不同。结论PIKA佐剂体内外直接通过诱导细胞因子的产生,B细胞和NK细胞的活化和增殖,而促进免疫应答反应。

CpG ODN佐剂促进HBsAg疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的探讨

目的 探讨cpG ODN对重组乙型肝炎表面抗原（HBsAg）诱导小鼠细胞免疫应答的影响。方法HBsAg和HBsAg＋CpG ODN分别肌肉注射免疫Balb／c小鼠后，从淋巴组织（脾和淋巴结）和非淋巴组织（肺）分离淋巴细胞，体外经HBsAg抗原刺激后，利用ELISA检测细胞培养液中IFN-γ的水平，再利用流式细胞仪在单个细胞水平上检测IFN-γ^＋细胞的频率，分析IFN-7^＋细胞亚群。结果对照组和HBsAg免疫组IFN-γ产生的水平很低，当HBsAg加强免疫1～2次后，IFN-γ表达仍然没有明显升高；而CpG ODN＋HBsAg免疫1次或加强免疫后，CpG显著促进HBsAg诱导的IFN-γ产生。进一研究结果表明CpG促进HBsAg诱导淋巴器官和非淋巴器官内CD4^＋和CD8^＋T细胞IFN-γ的表达。结论CpG免疫佐剂不仅能诱导细胞免疫应答同时也诱导体液免疫应答，提示CpG ODN可以用于HBsAg预防和治疗性佐剂。

IL-12和CpG疫苗佐剂体内对特异性CD4^+T细胞免疫应答的影响

目的:观察IL-12和CpG作为疫苗佐剂在体内促进抗原特异性CD4+T细胞的分化和IFN-γ的产生异同。方法:自CD4+T细胞受体转基因(TCR-Tg)小鼠脾和淋巴结分离CD4+T细胞,体外利用CFSE进行标记,然后被动输给相同基因的正常小鼠。经OVA、OVA+IL-12或OVA+CpG免疫后,观察抗原特异性CD4+T细胞的组织分布,IFN-γ的表达以及与细胞分裂之间的关系。结果:未经OVA抗原免疫的小鼠,抗原特异性CD4+T细胞未见有增殖反应。当经OVA抗原免疫后,可见脾和肺组织中细胞增殖;IFN-γ+细胞在脾脏、淋巴结和肺组织表达的阳性率很低,其范围为0.93%~2.17%。当经OVA+IL-12免疫后,IL-12促进IFN-γ的表达,阳性率为4.53%~26.79%;而经OVA+CpG免疫后,CpG只促进淋巴结中IFN-γ的表达(3.84%)。IFN-γ表达的细胞主要为分裂3~5次的细胞。结论:IL-12和CpG作为疫苗佐剂均可促进IFN-γ产生,促进细胞免疫应答。

CD107a/b分子用于评价SARS-CoV/S抗原特异性免疫应答

目的观察抗原刺激以后CD4+和CD8+T细胞表面CD107a/b分子的表达与效应性细胞因子的产生之间的关系。方法正常Balb/c小鼠脾细胞经多克隆刺激剂刺激或者SARS-CoV/SDNA疫苗免疫小鼠脾细胞经S抗原多肽刺激以后,使用流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞表面CD107a/b分子的表达与IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子的表达之间的关系。结果经抗原多肽刺激后,抗原特异性CD4+和CD8+T细胞表面均表达CD107a/b。约80%的CD8+IFN-γ+细胞同时表达CD107a/b;约25%～40%的CD8+TNF-α+细胞表达CD107a/b;而大部分分泌IL-2的抗原特异性T细胞均不表达CD107a/b。结论可以通过对抗原特异性T细胞表面CD107a/b分子的检测来鉴定抗原特异性T细胞。同时检测效应性细胞因子,可以提高检测的准确性和灵敏度。

SARS康复者M抗原特异性记忆性T细胞免疫应答的探讨

目的探讨SARS患者康复后,外周血单个核细胞(PBMCs)中是否存在SARS-CoVM抗原特异性T细胞。方法从完全康复期SARS患者和健康人外周血中分离PBMCs,体外经M混合多肽刺激后,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫斑点试验(ELISpot)及流式细胞仪检测技术,分析抗原特异性T淋巴细胞的反应性。结果在未经任何抗原刺激的情况下,PBMCs几乎不分泌IFN-γ。当SARS-CoVM混合多肽刺激后,SARS康复期患者的PBMCs分泌大量的IFN-γ,并可检测出高频率的IFN-γ产生细胞。与健康刺激组及康复期SARS患者未刺激组相比,差异显著(P<0.05)。流式结果显示,SARS康复期患者PBMCs经M多肽刺激后,分别有0.11%CD4+和0.16%CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ。根据IFN-γ和IL-2的表达与否,可将CD4+T细胞分为三个亚群IFN-γ-IL-2+、IFN-γ+IL-2+和IFN-γ+IL-2-。结论SARS-CoV感染后,机体可以产生针对SARS-CoVM蛋白的抗原特异性细胞免疫反应,其免疫记忆可以在体内维持很长时间。

绿脓杆菌制剂与IL-12在诱导人NK细胞IFN-γ产生中的协同作用

探讨绿脓杆菌制剂(piliated Pseudomonas Aeruginosa,PPA)与IL-12协同诱导人PBMC和NK细胞IFN-γ的产生。分离健康人PBMC和纯化NK细胞分别与培养液、PPA、IL-12或PPA+IL-12共同培养,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测无细胞培养上清中IFN-γ的水平。同时采用流式细胞仪在单个细胞水平上分析PPA和IL-12诱导IFN-γ产生的淋巴细胞亚群。结果显示,单独应用亚适剂量的IL-12或PPA刺激人PBMC或纯化NK细胞,不能诱导或只能诱导低水平IFN-γ的产生。当PPA和IL-12共同与人PBMC或纯化NK细胞孵育后,PPA呈时间和剂量依赖性与IL-12协同诱导PBMC和纯化NK细胞产生大量IFN-γ。细胞亚群分析的结果表明,PPA和IL-12协同诱导CD56+NK细胞产生IFN-γ,但对CD4+T和CD8+T细胞无明显作用。PPA与IL-12协同促进NK细胞IFN-γ的产生,提示PPA和IL-12能直接刺激NK细胞发生免疫应答。

人外周血卡介苗(BCG)特异性中央型和效应型记忆CD4^+ T细胞的特征

目的:探讨正常人外周血BCG特异性记忆T细胞的特征。方法:分离PPD-和PPD+正常人PBMCs,与BCG进行培养,采用ELISA法检测细胞培养上清液中IFN-γ的水平,ELISPOT法检测分泌IFN-γ的细胞数,利用流式细胞仪在单个细胞水平上检测细胞表面分子及细胞内因子IFN-γ和IL-2的表达及其关系。结果:当BCG刺激后,PPD-正常人PBMCs不产生或只产生少量的IFN-γ,而PPD+者IFN-γ产生的量和细胞数均明显增加(P<0·05)。流式细胞检测分析的结果表明,当BCG刺激后,主要是CD4+而非CD8+T细胞表达IFN-γ和IL-2,两者相比具有显著差异。在CD4+T细胞中单独产生IFN-γ的细胞占大多数,其次为IFN-γ和IL-2双阳性细胞,只产生IL-2的细胞占少数。此外,85%~95%以上的CD4+IFN-γ+T细胞为CD45RO+,其中60%以上的细胞为CCR7+,其余的为CCR7-。同样地,80%~95%左右的细胞为CD62L-。结论:BCG可以诱导抗原特异性记忆CD4+T细胞的产生,其中大多数为中央型记忆CD4+T细胞,少数为效应记忆CD4+T细胞,提示其在预防和控制结核分枝杆菌感染中发挥重要作用。

CD4^+T细胞的分裂与表面标志和细胞因子产生相关性的探讨

目的 :阐明抗原特异性CD4 + T细胞的分裂、细胞表面分子的表达和细胞因子产生之间的关系。方法 :从T细胞受体转基因小鼠 (DO11、10 )的脾和淋巴结中分离CD4 + T细胞。在抗原提呈细胞存在的情况下 ,经OVA多肽抗原刺激后 ,检测细胞的分裂、表型和细胞因子的产生。结果 :经抗原刺激 3天后 ,CD4 + T细胞分裂 1～ 5次 ,细胞膜表面抗原CD2 5、CD4 4的表达随着细胞的分裂而增加 ,相反 ,CD6 2L和CD6 9随着细胞分裂次数的增加而递减。细胞因子IFN γ、IL 4和IL 10随着细胞分裂次数的增加而递增。IL 12促进细胞的分裂 ,增加IFN γ的产生 ,抑制IL 4和IL 10的产生。结论 :当CD4 + T细胞活化后 ,随着细胞的分裂 ,其细胞膜表面分子的表达和细胞因子的产生均发生质和量的变化。

青藤碱对红斑狼疮患者外周血T细胞的抑制作用及机制探讨

目的:观察青藤碱(SIN)对系统性红斑狼疮患者T细胞功能的影响,探讨其免疫抑制作用机理。方法:分离SLE患者的PBMCs,加入anti-CD3及不同浓度SIN,以ELISA和流式细胞仪方法分析青藤碱对T淋巴细胞活化和Th1/Th2细胞因子产生的影响。结果:SIN可抑制SLE患者外周血T细胞产生IFN-γ、IL-2和IL-4。SIN能够显著降低CD4+T和CD8+T细胞表面活化分子CD69和CD25的表达。结论:SIN可通过抑制T细胞的活化及细胞因子的分泌,发挥免疫抑制作用。

Toll样配体(R-848)与IL-12对人NK细胞亚群IFN-γ产生的作用

目的:研究Toll样配体(R-848)与IL-12对人NK细胞IFN-γ产生的作用和细胞亚群分析。方法:分离人外周血PBMC和纯化的NK细胞,分别与R-848、IL-12或R-848和IL-12共同培养。利用ELISA法检测培养上清中IFN-γ的水平,再利用流式检测并分析产生IFN-γ的NK细胞亚群。结果:正常人PBMC分别与不同浓度的Toll样配体R-848、LPS、CpG培养后,均以剂量依赖的方式诱导IFN-γ的产生,但以R-848的效果最佳。细胞亚群分析的结果表明,R-848对CD4+T和CD8+T细胞IFN-γ的表达无明显作用,但显著地促进CD56+细胞表达IFN-γ。同样地,在IL-12刺激之下,CD56bright和CD56dimNK细胞表达IFN-γ。当R-848和IL-12与PBMC和纯化NK细胞孵育后,对CD56bright和CD56dimNK细胞IFN-γ的表达具有协同作用。结论:Toll样配体与NK细胞Toll样受体结合后,促进CD56brightNK细胞亚群IFN-γ的产生,而且Toll样配体与IL-12具有协同作用,提示Toll样受体与细胞因子在调控NK细胞的生物活性中发挥着十分重要的作用。

IL-4、IL-10和抗IL-12受体β1mAb抑制IL-23诱导正常人记忆T细胞IFN-γ产生

目的探讨重组人白介素23(IL23)是否能够诱导正常人T细胞IFNγ的产生,作用的靶细胞亚群和调节因素。方法正常人PBMC在抗CD3(antiCD3)单克隆抗体或antiCD3和抗CD28(antiCD28)单克隆抗体刺激的条件下与IL23进行培养,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液中IFNγ的水平;同时采用流式细胞仪,在单个细胞水平上分析IL23诱导PBMCIFNγ表达的T细胞亚群。结果在未经任何刺激的情况下,PBMC产生很低或不产生IFNγ。IL23呈剂量依赖方式促进由antiCD3活化的PBMCIFNγ产生。细胞亚群分析的结果表明,IL23诱导记忆CD4+和CD8+T细胞表达IFNγ,对活化的CD4+T细胞作用较为明显。Th2细胞因子(IL4、IL10)和抗IL12受体β1mAb(IL12Rβ1)抑制IL23诱导T细胞IFNγ产生。结论IL23促进活化的记忆CD4+和CD8+T细胞IFNγ的产生。Th2细胞因子和抗IL12Rβ1mAb抑制由IL23诱导IFNγ产生,提示这些细胞因子和抗体对IL23引起的自身免疫病具有拮抗作用。

环孢素A对小鼠脾细胞IFN-γ产生的影响

目的研究在不同刺激条件下,环孢素A(CsA)对小鼠γ-干扰素(IFN-γ)产生的影响。方法小鼠脾淋巴细胞分别使用抗CD3单克隆抗体(mAb)、抗CD3mAb+抗CD28mAb及抗CD3mAb+rIL-12刺激后,用ELISA法检测CsA对小鼠脾细胞IFN-γ产生的影响。在单个细胞水平上,用流式细胞仪检测CsA对脾细胞表面CD25和CD69表达及IFN-γ产生的影响。结果CsA对不同条件下诱导的小鼠脾细胞IFN-γ产生,均表现为剂量依赖性的抑制作用,其抑制机制与细胞的活化有关。结论CsA可以剂量依赖的方式抑制小鼠脾细胞表达CD25、CD69及产生IFN-γ。

IL-12体外促进慢性乙型肝炎患者PBMC IFN-γ的产生

目的:探讨体外IL-12对慢性乙型病毒性肝炎患者细胞免疫功能的影响,为临床治疗慢性乙型病毒性肝炎提供理论依据。方法:慢性乙型肝炎患者PBMCs与HBsAg、HBsAg+IL-12、HBcAg或HBcAg+IL-12孵育后,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清中IFN-γ的含量;用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)在单个细胞水平上检测PBMCs中IFN-γ产生细胞的频率;用流式细胞记数仪(FACS)检测PBMCs中IFN-γ+的细胞亚群。结果:当乙肝患者PBMCs与HBsAg或HBcAg孵育后,只有少数病例发生反应,产生低水平的IFN-γ。当IL-12加入细胞培养后,能显著地增加HBsAg或HBcAg诱导IFN-γ的产生;分泌IFN-γ的细胞频率显著增加;IFN-γ+的细胞主要包括CD8+T细胞和非T细胞。结论:IL-12体外能增强慢性乙型肝炎患者的细胞免疫应答。

Th2细胞因子和抗IL-12Rβ1mAb抑制由IL-23诱导PBMCIFN-γ的产生

目的:探讨重组人白介素23(IL-23)诱导正常人PBMC IFN-γ的产生,细胞亚群和调节因素。方法:正常人PBMC在不同条件下与IL-23进行培养,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液中IFN-γ的水平。同时采用流式细胞仪,分析IL-23诱导PBMC IFN-γ表达的细胞亚群。结果:IL-23呈剂量依赖性诱导PBMC IFN-γ产生,并可与IL-2协同诱导IFN-γ的产生。细胞亚群分析的结果表明,IL-23诱导高表达CD56+NK细胞产生IFN-γ,对CD4+和CD8+T细胞无明显作用。Th2细胞因子和抗IL-12受体β1mAb(IL-12Rβ1)抑制IL-23诱导IFN-γ产生。结论:IL-23可直接作用于CD3-CD56+NK细胞,诱导产生IFN-γ。Th2细胞因子和抗IL-12Rβ1mAb抑制IL-23诱导IFN-γ产生,提示可以用于由IL-23引起自身免疫病的治疗。

在单个细胞水平上分析抗原特异性Th1/Th2细胞因子产生的关联性

目的 在单个细胞水平上 ,观察抗原特异性Th1和Th2细胞因子产生的关联性 ,为进一步阐明CD4 + T细胞的分化 ,细胞因子产生的相互关系及其特征提供理论依据。方法 从OVA TCR转基因小鼠的脾和淋巴结中分离CD4 + T细胞 ,在体外在抗原提呈细胞存在下 ,用卵白蛋白 (OVA)抗原多肽刺激 3d后 ,再以同样的培养条件刺激 5～ 6h ,固定细胞 ,然后进行细胞表面和细胞内细胞因子染色 ,最后利用流式细胞仪在单个细胞水平上分析Th1和Th2细胞因子产生的关联性。结果 抗原特异性CD4 + T细胞经抗原再一次刺激后 ,分泌Th1(IFN γ和IL 2 )和Th2 (IL 4、IL 5和IL 10 )细胞因子。IL 12促进IFN γ的表达 ,控制Th2细胞的分化。此外 ,大多数抗原特异性CD4 + T细胞只产生 1种细胞因子 ,1个细胞同时产生 2种细胞因子极少见。结论 在单个细胞水平上的研究结果表明 ,经抗原短暂刺激后 (3d) ,不同的CD4 + T细胞亚群只产生 1种Th1和 或Th2细胞因子 。

不同刺激剂和培养环境对CD4^+、CD8^+ T细胞内细胞因子表达的影响

目的探讨不同的刺激剂和不同的培养条件对CD4+和CD8+T细胞内细胞因子表达的影响。方法分离正常人的外周血单个核细胞(PBMC),分别加入3种不同的刺激剂(PHA,抗CD3和抗CD28mAb,PMA和离子霉素),置于4种不同的培养环境下(室温,37℃水浴,37℃培养箱,37℃50mL/LCO2培养箱)培养4·5~5h。收集细胞,以荧光素-mAb标记后,用流式细胞术分析CD4+、CD8+T细胞内IL-2、IFN-γ和TNF-α的表达。结果CD4+和CD8+T细胞内细胞因子的表达,随着刺激剂的不同而有所差别,且在上述4种培养环境中,PMA的刺激效果最强,抗CD3mAb次之,PHA的刺激效应最弱。以上述3种刺激剂刺激后,不同培养条件对T细胞内细胞因子的表达有一定的影响。室温培养时几乎检测不到细胞因子的表达,而在37℃水浴、37℃培养箱和37℃50mL/LCO2培养箱中培养时,表达细胞因子的CD4+和CD8+T细胞的百分率差异无统计学意义(P>0.05)。结论不同刺激剂体外刺激T细胞表达细胞因子的效应不同,依次为PMA和离子霉素>抗CD3和抗CD28mAb>PHA。体外刺激培养的T细胞活化过程中,温度是重要的条件,CO2无明显影响。

利用多种表面标志鉴别正常人外周血初始和记忆T细胞亚群

目的探索能够准确鉴别初始和记忆T细胞亚群的表面标志及其关联性。方法自正常人静脉血中分离PBMCs,同时加入9种不同标记的抗体,进行染色,利用流式细胞仪检测,并分析结果。结果CD45RA+CD4+T细胞均表达CD27、CCR7、CD28和CD62L,而在CD45RA-CD4+T细胞中,约有75%的细胞表达CD27,30%为CCR5+,90%为CCR7+,99%为CD28+,70%为CD62L+。与其相一致的是在CD62L+CD4+T细胞中,大约60%的细胞为CD45RA+,但CD62L-CD4+T细胞中,大约95%的细胞为CD45RA-。在CD8+T细胞中,大约有78%的细胞为CD45RA+,其余为CD45RA-。CD45RA+CD8+T细胞的表型与CD45RA+CD4+T细胞基本相似。结论同时检测多种T细胞表面标志,深入了解T细胞各亚群的表型特征,对疾病的诊断、治疗、预后判断以及疫苗的设计和效果评价具有重要的指导意义。

细胞因子直接诱导正常人CD4^+T细胞产生IL-17和IFN-γ

目的:探讨细胞因子(IL-23、IL-2和IL-15)对正常人外周血单个核细胞(PBMC)和CD4+T细胞IL-17产生的诱导作用和调节因素。方法:将正常人PBMC和纯化的CD4+T细胞在不同条件下与IL-23、IL-2和IL-15进行培养,采用ELISA法检测细胞培养液中IL-17和IFN-γ的水平;采用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)在单个细胞水平上检测IL-17和IFN-γ产生细胞的频率。结果:IL-23可诱导PBMC产生IL-17和IFN-γ;Th2细胞因子和抗IL-12受体β1(IL-12Rβ1)mAb可抑制IL-23诱导的IL-17和IFN-γ产生。IL-2和IL-15均可诱导IL-17和IFN-γ产生,并与IL-23具有共同诱导作用。IL-12可诱导PBMC产生大量的IFN-γ,但不产生IL-17。进一步研究表明,IL-23、IL-2和IL-15可直接诱导纯化的CD4+T细胞产生IL-17和IFN-γ。结论:IL-23、IL-2和IL-15可直接作用于正常人CD4+T细胞诱导其产生IL-17和IFN-γ;Th2细胞因子和抗IL-12Rβ1mAb可抑制IL-23诱导的IL-17和IFN-γ产生。为探讨自身免疫性疾病等的发生机制和治疗提供了新的靶点。