分子医学及其技术

分子医学是涵盖医学分子生物学基础理论、医学分子生物学常用实验技术及其在医学研究中的应用等的综合性学科。分子医学与传统医学最根本的区别在于前者可在基因水平上对疾病进行操作 ,所以分子医学技术已成为推动分子医学发展的重要工具。本文较全面阐述分子医学和分子医学技术的主体内容 ,并指出其在医学发展中的重要性。分子医学的发展将逐渐改变目前以经验医学为主导的局面 ,分子医学技术将成医学工作者必须掌握的基本技能 ,使基础研究和临床应用更紧密地相互联系 ,使科研成果更快速地向临床转化 ,使实验医学和经验医学有机地融合起来 ,这将是未来医学发展的方向。

人纤维蛋白溶酶原kringle5(K5)抑制小鼠肝癌的血管生成和肿瘤生长

【目的】体内、体外实验观察人纤维蛋白溶酶原kringle5(K5)对肝癌血管生成和肿瘤生长的影响。【方法】大肠杆菌中表达,组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得K5蛋白,SDS-PAGE和Westernblot方法鉴定K5蛋白的表达;MTT法分析K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞(BRCEC)和肝癌细胞株Bel-7402、HepG2增殖的影响;建立皮下种植肝癌鼠模型,瘤内注射K5,检测抑瘤率及肝癌组织微血管密度(MVD)。【结果】SDS-PAGE及Westernblot鉴定获得K5纯化蛋白;K5特异性地抑制BRCEC的增殖,IC50=160nmol/L,而对肝癌细胞株Bel-7402、HepG2的增殖无抑制作用;K5显著抑制小鼠肝癌生长,治疗组肝癌组织MVD明显低于对照组。【结论】K5抑制移植性小鼠肝癌血管生成和肿瘤生长,特异性抑制血管内皮细胞的增殖可能是K5抑制肝癌血管生成的主要机制。K5具有治疗肝癌的潜在临床价值。

人纤溶酶原K5突变体Ⅰ的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

【目的】 构建人纤溶酶原Kringle 5(K5)的突变体Cys461-Cys540(K5 mut1),在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,为探讨K5抗血管增生活性与Kringle结构域的关系提供基础?【方法】 以K5全长cDNA为模板用PCR的方法扩增人纤溶酶原K5 mut1基因,将其克隆进表达载体pET-22b(+)中,并用限制性核酸内切酶酶切和DNA测序鉴定其连接正确;pET-22b(+)/K5 mut1 转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,表达产物用固化Ni2+-His Bind Resin亲和层析方法纯化,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot方法分析鉴定?【结果】 PCR扩增获得258 bp的人纤溶酶原K5 mut1基因片段,正确插入pET-22 b(+)载体,在大肠杆菌中该基因编码蛋白的表达量占菌体总蛋白13%左右;SDS-PAGE显示其相对分子质量Mr≈14.1×103,Western blot证实该表达蛋白为K5 mut1重组蛋白,经亲和层析后K5 mut1重组蛋白纯度大于90%,获得率约为10 mg/L?【结论】 成功构建人纤溶酶原K5 mut1,实现在大肠杆菌中高效表达,亲和层析纯化获得较高纯度K5 mut1重组蛋白?

端粒酶锤头状核酶抑制肺癌细胞端粒酶活性及细胞增殖的实验研究

目的:探讨端粒酶特异性核酶对A549肺癌细胞端粒酶活性、增殖和凋亡的影响。方法:构建人端粒酶锤头状核酶真核表达质粒,稳定转染人A549肺癌细胞株。RT-PCR法检测核酶的表达以及hTERT mRNA、hTR的含量,TRAP法测定细胞端粒酶活性,MTT法、流式细胞仪等测定细胞增殖及凋亡。结果:稳定转染核酶重组体的细胞克隆,均可以检测到核酶的表达,端粒酶活性被抑制,clonehTERT1～6和clonehTR(1、3、5)的平均端粒酶活性分别是空白对照组的(27±18)%和(36±13)%,P值分别为0.000和0.013;clonehTERT1～6hTERT mRNA及clonehTR1～6hTR含量下降,分别是空白对照组的(30±19)%和(49±17)%,P值分别为0.000和0.001;clonehTERT1、clonehTR3生长较空白对照组及阴性对照组减缓,凋亡率增加;而clonehTERT1又较clonehTR3生长慢,凋亡率高(凋亡率分别为21.5%和16.1%)。结论:端粒酶特异性核酶能明显抑制端粒酶活性和细胞增殖,促进细胞凋亡;端粒酶hTERT mR-NA可能是比端粒酶RNA更为理想的端粒酶抑制剂的靶点。

乙型肝炎病毒C基因在毕赤酵母中的表达

目的研究乙肝病毒核心(C)基因在毕赤(Pichiapastoris)酵母中的表达,以期获得高效表达的具有良好免疫反应性和特异性的重组乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)。方法采用PCR法从含HBV全基因序列的质粒pHBV1中扩增C基因,亚克隆到pGEM-T载体中,经DNA序列分析后将目的基因定向克隆到酵母表达载体pPIC9中,构建重组质粒pPIC9-cAg。然后用电转法将重组质粒转化入酵母菌GS115,05%甲醇诱导表达。采用SDS-PAGE、Westernblot和ELISA法对表达产物进行分析。结果限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBVC基因已正确克隆到酵母表达载体pPIC9中;SDS-PAGE结果显示重组HBcAg在毕赤酵母细胞中表达;ELISA及Westernblot分析表明,表达产物具有良好的免疫反应性和特异性,重组HBcAg的滴度可达1∶12800。结论成功构建了pPIC9-cAg重组质粒,并在毕赤酵母中高效表达了具有良好免疫反应性和特异性的重组HBcAg,为进一步研制抗-HBc诊断试剂盒奠定了基础。

生物芯片在幽门螺杆菌抗体谱检测中的临床应用

目的探讨应用生物芯片仪和幽门螺杆菌(HP)抗体芯片,在检测幽门螺杆菌抗体谱中的应用价值。方法针对幽门螺杆菌抗体之一的细胞毒素相关蛋白(CagA-HP)IgG抗体,应用酶免疫检测试剂盒,对比生物芯片仪和幽门螺杆菌抗体芯片,检测幽门螺杆菌CagA抗体,进行方法学比较分析。同时检测幽门螺杆菌的抗体谱,包括抗CagA、抗VacA、抗Ure、抗Hsp60、抗RdxA抗体,并进行重复性实验。结果两种方法检测结果符合率为96.7%,两种非独立样本比率相等检验,χ2=0.25,P>0.05,认为两种检验方法的阳性率相等,两方法呈正相关联,关联系数r=0.936;蛋白芯片重复性实验结果显示检测重复性好,五种抗体总重复率分别为97.5%～100%。结论生物芯片仪和相关蛋白芯片可以应用在临床幽门螺杆菌抗体检测中,具有检测快捷、方便的特点,并可以得到多信息量的临床诊断与分析。

生物化学动画库的构建及其应用

针对生物化学学科特点和Flash独特的优势,结合教学实际,构建了生物化学Flash动画库,提供了一批形象直观的动画,并应用于生物化学的教学实践,充分显示了Flash在提高生物化学教学质量方面所具有的潜力。

端粒酶活性及其hTERT基因在增生性组织中的表达

目的:探讨端粒酶在增生性组织中的表达状况。方法:采用Kim的TRAP法和RT-PCR技术检测增生性肉芽组织、子宫内膜组织以及部分生长旺盛的癌旁组织的端粒酶活性及其催化亚基hTERT基因的表达。结果:以Hela细胞对照作为阳性对照,3类组织可部分检测到低水平的端粒酶活性及hTERT基因的表达。结论:端粒酶在生长旺盛的增生性组织中呈低水平表达,与细胞的生长状态有关。

凝胶迁移阻滞法分析人类端粒酶的DNA结合特性

目的采用凝胶迁移阻滞法分析研究人类端粒酶DNA结合特性。方法以地高辛标记的人端粒序列寡核苷酸与人端粒酶提取物进行结合反应,以未参与结合反应的单纯标记寡核苷酸作为参照。实验所设的3组样品中,第一组和第二组标记寡核苷酸加端粒酶,第一组显示一条阻滞性条带,第二组显示两条条带,前方的一条与第一组条带平行,为单纯探针条带,后方的一条迁移率被阻滞,应为探针与纯化的蛋白复合体相结合的结果;第三组为标记寡核苷酸加端粒酶阴性洗涤液,只显示单一探针条带。结果只有人端粒序列寡核苷酸与人端粒酶提取物结合反应管显示特异的凝胶迁移阻滞性电泳条带。结论人端粒酶具有和端粒DNA片段结合的特性。

生物化学网络课程设计的一些技巧

针对生物化学学科特点和网络课程的优势,结合教学实际,编制一种在网络环境下运行的生物化学网络课程。编制的重点从总体设计和页面设计以及设计过程中的一些技巧来阐述,以达到引导学生积极探索、认真思考、进行自主学习的目的。

淋巴母细胞端粒酶活性和成瘤性的关系

目的 EB病毒相关的淋巴母细胞(lymphoblastoid cell lines,LCLs)有较高的端粒酶活性。本实验旨在分析淋巴母细胞成瘤性与端粒酶活性的关系。方法采用端粒重复扩增法(telomericrepeat amplification protocol,TRAP)分别测定淋巴细胞源性肿瘤细胞以及EB病毒相关淋巴母细胞的端粒酶活性,并对淋巴母细胞的成瘤性进行体内体外试验。结果 5株EB病毒相关的LCLs端粒酶活性与细胞传代次数有关,它们都能在免疫缺陷小鼠体内致瘤。结论容易形成集落的细胞系更容易在小鼠体内致瘤,也具有更高的端粒酶活性。

双位点保守基因特异性PCR-CE-RFLP快速鉴定病原菌的实验与临床研究

[目的]初步建立一个临床常见病原菌的标准PCR-CE-RFLP数据库,为临床快速鉴定病原菌奠定基础。[方法]选取临床分离的病原菌共167株,筛选16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因的合适引物,分别用FAM和JOE两种荧光素标记,调整PCR反应条件,让两种引物能同时在同一条件下反应,所得产物先用普通琼脂糖凝胶电泳,再分别用限制性内切酶HaeIII进行不完全酶切,酶切产物50倍稀释后进行毛细管电泳(PCR-CE-RFLP),测定酶切片段长度差异。[结果]针对16S rRNA基因的RFLP谱数据只能将病原菌鉴定到"科"的程度,而单纯应用16S-23S rRNA间区基因的RFLP谱数据虽能区分绝大多数细菌,但个别种属内仍然出现相似的谱型。经过双位点PCR-CE-RFLP分析后,则可将所有细菌鉴定到"种"的程度。[结论]利用16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因PCR-CE-RFLP进行细菌鉴定简便快捷,能将传统方法需要十几个小时甚至几十小时的鉴定工作缩短到几个小时,是一种极有临床应用价值的快速诊断方法。

癌胚抗原肿瘤基因疫苗胶囊的研制

目的研制癌胚抗原(CEA)阳性肿瘤基因疫苗结肠溶胶囊。方法通过分子克隆技术将加强型绿色荧光EGFP cDNA连接于CEA cDNA的上游,构建示踪子EGFP-CEA融合基因疫苗pVGC2。使用特制的微小结肠溶空心胶囊制备鼠用基因疫苗口服胶囊。收集小鼠口服用药后的腹腔游离细胞,采用荧光显微镜观察绿色荧光以便评估EGFP-CEA融合蛋白质的表达情况。结果所构建的重组质粒的目的基因片段测序结果证实所接入的EGFP-CEA cDNA序列与母本cDNA序列100%一致。所制备的口服胶囊的平均溶出度为(91.1±3.65)%。检测结果显示,口服胶囊后小鼠腹腔游离细胞中可见到绿色荧光。结论成功地制备了口服基因疫苗胶囊。小鼠腹腔游离细胞中绿色荧光融合蛋白的表达预示,口服基因疫苗胶囊是一种潜在可行的抗肿瘤免疫途径。

Survivin在非小细胞肺癌中表达的初步研究

目的 :探讨survivin基因在非小细胞肺癌 (non smallcelllungcancer,NSCLC)中的表达情况 ,为survivin基因用于NSCLC诊断以及治疗提供理论依据。方法 :用RT PCR法检测正常细胞株、肺癌细胞株、非小细胞肺癌活体标本以及癌旁组织 ,比较survivin基因的表达情况。结果 :正常细胞株以及癌旁组织中未检测出survivin表达 ,肺癌细胞株以及肺癌活体标本有高表达。结论 :survivin可能作为非小细胞肺癌的检测以及治疗新靶点。

泪液乳铁蛋白夹心法酶联免疫吸附试验的建立及初步临床应用

泪液乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是泪液中最主要的抗菌蛋白质，对眼表组织起积极防护作用，其含量在很大程度上能反映泪腺的外分泌功能。干眼是与泪膜密切相关的眼表疾病，病因复杂、临床表现多样，诊断存在较大困难。多项研究表明，泪液LF含量检测可能是诊断干眼最敏感特异的指标。本研究应用噬菌体抗体库技术和动物免疫制备了抗人LF单链抗体和兔抗人LF多克隆抗体，建立LF的双抗夹心酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法，以检测泪液LF含量，评价该指标对于干眼的诊断价值。

阿尔茨海默病血清蛋白质组学研究

目的对6例阿尔茨海默病（AD）患者血清二向电泳前预处理，去除高丰度蛋白，增加低丰度蛋白的检测效果。方法采用去除白蛋白球蛋白试剂盒对受试者血清进行预处理．然后二向电泳，结合质谱仪分析来鉴定兴趣蛋白质。结果通过对比AD组和对照组二向电泳图．得到24个差异蛋白质点，对这些差异蛋白点进行质谱仪分析，发现6例AD病人血清触珠蛋白表达增高，而只有3例AD病人血清转甲状腺素蛋白㈣表达降低。结论对AD血清二向电泳前预处理可以提高低丰度蛋白的检测效果，提示该方法可很好地用于鉴别AD血清生物标记。

触珠蛋白可能是阿尔茨海默病患者血清生物标记

阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）是老年人群中最常见的变性性痴呆.目前,AD尚无可靠的死前诊断指标.蛋白质组学（proteomics）作为研究蛋白质谱和蛋白生物功能的新学科,在神经变性疾病研究中已成为一个非常有价值的方法.我们于2004年11月至2005年5月应用蛋白组学方法对AD患者血清蛋白进行研究,以期发现对AD诊断有价值的生物学指标.

结核分枝杆菌KatG基因突变与对异烟肼耐药的关系

目的探讨结核分杖杆菌KatG基因突变与对异烟肼耐药程度的关系。方法对临床分离的6I株结核分枝杆菌异烟肼耐药株（其中高浓度耐药株49株．低浓度耐药株12株）和42株结核分枝杆菌异烟肼敏感株进行DNA序列分析。结果61株异烟肼耐药株中，检测到50株存在KatG S315T（AGC→ACC）基因突变、1株存在Ser315Arg（AGC→AGA）的突变，1株发生Val319Asp（GTC→GAC）突变，突变率为185．2％（52／61）。其中高浓度耐药株中有46株检出发生S315T突变，1株发生Val319Asp突变，突变率为95．9％（47／49）；低浓度耐药株中有4株检出发生S315T突变，1株发生Sex315Arg（AGC→AGA）的突变，突变率为41．7％（5／12）；42株异烟肼敏感株DNA序列分析均没有检测到KatG基因突变。结论KatG基因突变是结核分枝杆菌耐异烟肼的主要分子机制，异烟肼高浓度耐药株的KatG基因突变率远高于低浓度耐药株的基因突变率。