日本血吸虫精氨酸酶新基因的鉴定及作为疫苗的保护性研究

目的识别和鉴定日本血吸虫(Sj)精氨酸酶(ARG)新基因,并研究纯化的重组SjARG对Sj感染小鼠的保护性。方法通过巢式PCR,从日本血吸虫尾蚴cDNA文库特异扩增ARG基因cDNA序列的5′端,并用生物信息学进行鉴定;将ARG的完整编码序列(CDS)克隆到pET30a(+)载体,表达并纯化表达产物后,以鸟氨酸-茚三酮法鉴定酶活性;用蛋白质印迹法(Westernblotting)比较重组ARG蛋白与Sj天然ARG蛋白的免疫学特性,间接免疫荧光法对ARG在Sj成虫中的分布进行组织定位;用纯化重组ARG蛋白免疫小鼠(PBS和SjGST作对照),Sj尾蚴攻击感染后,检测SjARG作为疫苗的免疫保护力。结果扩增并鉴定SjARG基因的完整CDS长为1095bp;重组SjARG具有酶活性,并具有与Sj天然ARG蛋白相同的免疫学特性;ARG定位于Sj成虫的肠壁和生殖器官。重组SjARG蛋白免疫后的减虫率和减卵率分别为55.8%和48.8%。SjGST蛋白免疫后的减虫率和减卵率分别为28.6%和6.89%。结论获取并鉴定了SjARG新基因;SjARG比SjGST具有更高的疫苗保护性。

羊胎素对体外成骨细胞增殖、分化及矿化功能的影响

目的 观察羊胎素在体外对新生大鼠颅骨成骨细胞增殖、分化及矿化功能的影响。方法将提取之羊胎素稀释加入体外培养的SD新生大鼠颅骨成骨细胞体系中,终浓度分别为0.625％、1.25％、2.5％、5％和10％;加药后24、48和96 h用MTT法检测细胞的增殖并绘制生长曲线:培养5 d时用PNPP法测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性;培养31 d时用茜素红染色2.5％羊胎素组形成之矿化骨结节,用图像分析仪计算骨结节的面积。结果 所有含羊胎素浓度组,其MTT法测得的A值都显著高于空白对照组(P<0.01),生长曲线表现为含羊胎素组的细胞增殖加快,以2.5％浓度组最为显著;ALP结果显示,羊胎素各浓度组的碱性磷酸酶活性都显著高于空白对照组(P<0.01);茜素红染色后显示,2.5％羊胎素组所形成的骨结节面积显著高于空白对照组(P<0.01)。结论羊胎素对体外培养的SD新生大鼠颅骨成骨细胞有显著的促进增殖、分化和矿化的作用。

华支睾吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因的原核表达及重组蛋白的功能鉴定

目的克隆肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因并在大肠杆菌内表达,同时对表达的重组蛋白进行初步的功能分析,为进一步的研究和药物筛选打下基础。方法通过大规模测序从肝吸虫cDNA文库中确定肝吸虫线粒体苹果酸脱氢酶基因,采用PCR方法扩增出目的片段,与表达质粒pGEX-4T-1连接构建重组质粒,IPTG诱导表达;研究重组蛋白的理化性质及酶动力学特征,并寻找可能的抑制剂。结果成功表达出约64 kDa的重组蛋白,凝血酶切后为36 kDa蛋白,其酶活性为63.6U/mg。1.14 mM 4,4′-二甲氨基联苯甲醇处理30 min酶活性下降了60%;吡喹酮、灭滴灵和阿苯哒唑对酶活性无抑制作用;而5’-单磷酸腺苷对重组酶有竞争性抑制作用,其Ki为0.49。结论成功地表达了目的蛋白,为药物筛选提供了一个易于获得的候选蛋白分子。

恙虫病东方体Karp株核酸疫苗的构建及其免疫功能初步研究

目的构建恙虫病东方体Karp株Sta56抗原候选核酸疫苗并初步探讨其可能诱导的免疫功能。方法从连有恙虫病东方体Karp株编码56000u表膜蛋白基因开放读码框全长的T载体质粒pMD18/Sta56中双酶切出目的基因,定向亚克隆构建核酸疫苗质粒载体pVAX1-Sta56,转染Hela细胞,WesternBlot分析Sta56蛋白的表达及其免疫原性,转染L929细胞,接种恙虫病东方体,Giemsa染色细胞内恙虫病东方体数目比较,初步探讨pVAX1-Sta56可能诱导的细胞免疫现象。结果pVAX1-Sta56连有正确读码框架的Sta56全长基因。转染有pVAX1-Sta56的Hela细胞培养上清可检测到被兔抗恙虫病东方体Karp株抗血清识别的特异条带。转染有pVAX1-Sta56的L929细胞内恙虫病东方体数目显著少于转染pVAX1的L929细胞(P<0.01)。结论成功构建能够表达Sta56表膜蛋白抗原的核酸疫苗载体pVAX1-Sta56,并能诱导产生细胞免疫功能。

华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶活性位点氨基酸点突变对酶活性和热稳定性影响

目的为了研究华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸的点突变对酶活性和热稳定性的影响,进一步了解蛋白分子结构与功能的关系。方法利用PCR技术,对胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸基因进行点突变,与pQE30质粒连接构建重组质粒,转染大肠杆菌后表达蛋白,测定酶活性和圆二色性,测定不同温度时222nm圆二色性改变,确定不同点突变蛋白的热稳定性。结果H195被异亮氨酸、半胱氨酸和酪氨酸置换后,酶活性下降了100倍以上,但随着H195被不同氨基酸置换和H195周围氨基酸被置换情况的不同,不同突变株表达的蛋白酶活性差别很大,H195/I195和H195/Y195突变株表达的蛋白酶活性明显高于H195N197/I195Y197和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白酶活性;H195/Y195突变株表达的蛋白与未突变蛋白的二级结构差异明显;H195/Y195和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白热稳定性明显降低,tm值分别为63.5℃和64℃,比Cs cMDH的tm值分别下降了4℃和3.5℃。结论活性中心H195的点突变可导致华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶活性的明显下降,而且H195被不同的氨基酸置换后可导致酶活性下降程度的不同,H195周围氨基酸被替换成具有形成氢键或二硫键的氨基酸后,导致酶活性下降更为明显;H195及其周围氨基酸的突变可导致蛋白质二级结构的改变和热稳定性的不同程度下降。

组蛋白与基因调控研究进展

组蛋白是染色体的结构蛋白,它与DNA组成的核小体是染色体的基本结构单元。组蛋白能保护DNA免被核酸酶消化。除此之外组蛋白还有多种功能,它在基因调控、肿瘤细胞增殖、调亡、DNA修复以及衰老中发挥重要作用,它同时还是先天免疫的有效分子。本综述重点讨论了组蛋白的结构以及它们在基因调控中所发挥的调节作用。

弓形虫不同分离株α-Tubulin和β-Tubulin基因PCR-RFLP分析及其探针制备

目的不同分离株弓形虫α-Tubulin和β-Tubulin基因的PCR-RFLP分析及其杂交探针制备。方法PCR体外扩增α-Tubulin和β-Tubulin基因片段并进行RFLP分析;采用随机引物法用地高辛(DIG-11-dUTP)标记探针并同基因组DNA进行Southern杂交分析。结果从5株弓形虫分离株的基因组DNA中均扩增出α-Tubulin基因的818bp片段和β-Tubulin基因的959bp片段,RFLP分析弓形虫各分离株间酶切图谱未见差异。探针的特异性和敏感性较好。结论α-Tubulin和β-Tubulin基因在弓形虫中高度保守;α-Tubulin和β-Tubulin基因杂交探针可用于Southern杂交。

不同分离株弓形虫hsp70基因体外扩增及其酶切分析

目的 不同分离株弓形虫hsp70基因的比较 ;运用限制性内切酶分析 (PRA)建立一种简单的虫株鉴定方法。 方法 采用PCR技术扩增hsp70基因 ;采用 3种限制性内切酶Bsp12 86Ⅰ、BstXⅠ、MboⅠ分别对该基因进行酶切比较。 结果 从 5种不同分离株的弓形虫基因组DNA中扩增出相似的约 2 0 2 2bp的完整HSP70基因阅读框序列 ;Bsp12 86Ⅰ酶切 5株弓形虫有 2组不同酶谱 ,而BstXⅠ、MboⅠ酶切的片段各株间没有差异。结论 5种不同分离株弓形虫的hsp70基因片段大小基本相同 ;但酶切图谱有差异 ,这可以为虫株鉴定和毒力研究提供参考。

日本血吸虫再感染相关蛋白基因的克隆和原核表达(英文)

目的 从日本血吸虫 (S .japonicum )尾蚴文库扩增S .japonicum再感染相关蛋白 (RIRP)基因 ,进行克隆并原核表达出RIRP ,为进一步的功能研究奠定基础。 方法 根据已登陆的S .japonicum成虫期RIRP基因的序列设计两条特异引物 ,以S .japonicum尾蚴cDNA文库为模板扩增RIRP基因cDNA ,将该基因的cDNA克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1和真核载体 pcD NA3 .1。转化的克隆通过氨苄青霉素的筛选、PCR扩增、双酶切和最后的测序鉴定。重组的 pGEX 4T 1/RIRP在大肠埃希菌BL2 1(DE3 )中进行表达。SDS PAGE鉴定其在大肠埃希菌中的表达情况和分子质量。用抗 2 6kuGST单抗作western杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。 结果 从S .japonicum尾蚴文库中扩增出一条长为 462bp的cDNA片段 ,经测序证实其为RIRP基因的全长cDNA。它编码含 15 3个氨基酸的蛋白质—RIRP ,预测其分子质量单位为 17.5 45ku。RIRPcDNA已被成功克隆入 pGEX 4T 1和pcDNA3 .1载体 ,大肠埃希菌BL2 1(DE3 )编码一个约 17ku的蛋白质。 结论 RIRP基因首次从S .japonicum尾蚴文库中扩增出来 ,并成功构建了原核和真核表达载体 ,而且 ,它首次由大肠埃希菌表达 ,表达蛋白的分子质量单位约 17ku。

蚊媒体内登革病毒的快速分型检测

目的建立一种用于蚊媒体内登革病毒(DEN)快速检测和分型的实验方法。方法利用标记地高辛(Dig)的登革病毒通用引物进行RT-PCR扩增蚊媒体内的病毒RNA,然后以反向斑点杂交法检测病毒扩增片段并进行分型。结果RT-PCR可扩增出预期的DEN基因片段,杂交检测和分型结果特异,易于判断,可测出3pg的病毒RNA。结论该方法灵敏、特异、稳定性好,可用于登革病毒分型及混合感染的检测,4h左右即可获得结果,为早期快速诊断蚊媒体内的登革病毒提供了一种可靠方法。

广州东部HPV基因型分布及其优势基因型E6／E7核酸序列分析

目的研究广州东部人乳头瘤病毒基因型分布特征,并获取优势基因型早基因E6/E7的核酸序列,进行变异分析,为本课题组下一步新型分子诊断方法的研发提供目标序列。方法通过导流杂交基因芯片技术进行宫颈脱落细胞标本的人乳头瘤病毒基因分型检测,分析本地区基因型分布特征,确定优势基因型;根据GenBank序列设计特异性引物,用于扩增优势基因型的早基因E6/E7的编码区序列,克隆后测序并对序列进行变异分析。结果通过导流杂交基因芯片技术进行宫颈脱落细胞标本的分型检测,检测了536份宫颈脱落细胞标本,HPV阳性占27.2%(146/536),其中多基因型感染占29.5%(43/146),高危型感染中52型为优势基因型,频数达23.3%(37/159)。HPV感染与52型HPV感染的年龄分布显示低年龄组(即A组,≤25岁)妇女最高。3份52型HPV感染阳性标本的核酸模板,通过特异性引物均成功扩增出大小接近750bp的目的序列;分别克隆到T载体上并测序,得到3条人乳头瘤病毒52型早表达基因E6/E7的编码区序列,克隆后测序并对序列进行变异分析;3条序列经BLAST分析,与GenBank数据库HPV52型序列(Accession:X74481)的E6/E7编码区序列一致性均为99%,三条序列(EU924143、EU924144、EU924145)存在6种碱基置换,其中2种可引起所编码的相应氨基酸残基改变。结论本研究可确认广州东部地区妇女宫颈感染HPV中A组(17-25岁)具有最高的感染率;宫颈感染HPV的优势基因型为52型;我们通过克隆策略得到了与HPV高危型52型X74481高度相似的E6/E7编码序列,为课题组后续进行的HPV致病机制和新型分子检测方法研究提供了重要基础。

慢性肾衰竭大鼠肠道通透性及损伤的研究

目的探讨慢性肾衰竭（CRF）大鼠肠道通透性及损伤的变化。方法 雄性sD大鼠20只分为CRF组（n=10）和对照组（n=10），采用5／6肾切除制备CRF大鼠模型，定期监测血生化至模型成功建立。术后第12周，大鼠禁食12h后灌饲含有1g乳果糖（L）和O．5g甘露醇（M）的测试液4ml，收集大鼠口服测试液后6h内的全部尿液，采用高压液相色谱一示差法（HPLC—RID），检测尿液排泄率比值（L／M），评估大鼠肠黏膜通透性水平；HE染色观察各组大鼠小肠黏膜光镜下的形态（肠黏膜绒毛高度、肌层厚度、绒毛数量）并行组织学损伤评分。结果CRF组大鼠尿L／M比值高于对照组（1．75±0．11比1．20±0．06，P〈0．01）；其肠黏膜绒毛高度、肌层厚度显著高于对照组（P〈0．01），绒毛数量显著低于对照组（P〈0．01）。CRF组大鼠肠道病理组织学评分显著高于对照组（1．00±0．71比0，P〈0．01）。结论CRF大鼠肠道通透性增加，并且伴有不同程度的肠道损伤。