构建无背景的选择性感染噬菌体

目的构建一个选择性感染噬菌体(selectively infective phage,SIP)载体。方法删去M13KO7gIII基因的第2个甘氨酸丰富区,并在此位置插入3个内切酶识别位点,用于外源基因的插入,构建成重组噬菌体基因组BP-M13KO7。将重组噬菌体BP-M13KO7的培养液上清液感染XL1-Blue,检测其感染背景。结果重组噬菌体BP-M13KO7培养液上清液不具有感染性,完全消除了背景。结论通过将M13KO7gIII基因的第2个甘氨酸丰富区置换成3个内切酶识别位点,构建成的重组噬菌体无感染性背景。

人趋化因子受体CCR5胞外片段的融合表达与纯化

目的对人趋化因子受体CCR5的N端胞外部分与第二个胞外环(extracellular loop-2,ECL-2)进行融合表达与纯化。方法分别扩增人趋化因子受体CCR5的胞外N-端部分与ECL-2部分相应的编码序列,通过重叠延伸拼接(Splicing byoverlapping extension,SOE)PCR实现两片段DNA的拼接后(命名为CCR5-N-E2)克隆入质粒pBlueScript M13中,同时构建原核表达载体pET-21b(+)-CCR5-N-E2,转入表达菌株BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白CCR5-N-E2,表达产物通过蛋白免疫印迹进行鉴定,并采用金属螯合层析法对重组表达产物进行纯化。结果经测序,构建的重组原核表达载体与预期完全一致,相对分子质量为8 500的目的蛋白在BL21(DE3)菌株中得到高效表达,表达量约占总蛋白的50%,表达产物以包涵体形式存在。蛋白免疫印迹实验表明该重组蛋白与抗CCR5 N-端序列的单克隆抗体发生特异性结合。通过Ni2+亲和层析,目的蛋白的纯度可达95%以上。结论实现CCR5-N-E2编码序列的拼接、融合蛋白的表达以及纯化,为广泛筛选以CCR5为靶点的临床治疗药物奠定了基础。