汉森酵母表达载体的构建和人血管生成抑制素基因的表达

汉森酵母 (H .polymorpha)是一类能以甲醇为唯一碳源和能源的甲基营养酵母 ,具有高表达外源基因、易于高密度发酵和产业化的特点。应用PCR技术扩增汉森酵母甲醇氧化酶 (MethanoloxidaseMOX)基因启动子和转录终止序列 ,并与汉森酵母Leu基因 (Hpleu2 )和人血管生成抑制素基因一起重组进大肠杆菌质粒pSP72 ,构建了整合型表达载体pSMA1 7,采用LiAc法将pSMA1 7转入汉森酵母A1 6 (leu) ,筛选出阳性转化子H .polymorphaA1 6 (pSMA1 7)。转化子在YPGE培养基中培养至对数生长后期 ,用甲醇进行诱导表达。ELISA和SDS PAGE分析结果证明人血管生成抑制素已获表达 ,表达产物分泌至培养基中。Westernblot结果显示重组的人血管生成抑制素能与抗人纤溶酶原抗血清特异结合 。

用GAP启动子在毕节酵母中组成型表达人血管抑制素(英文)

为探索用GAP启动子 (PGAP)取代AOX1启动子 (PAOX1) ,在毕节酵母 (P .pastoris)中组成型表达外源蛋白的可能性 ,应用PCR方法从P .pastoris染色体中扩增了GAP启动子 ,以其取代诱导型表达载体 pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体 pGAP9K。将人血管抑制素 (AS)基因重组于pGAP9K的多克隆位点 ,获得含AS基因的重组质粒 pGAP9K AS。转化P .pastorisGS115 ,对获得的高拷贝转化子P .pastorisGS115 (pGAP9K AS)进行组成型表达 ,同时以诱导型转化子P .pastorisGS115 (pPIC9K AS)作为对照。SDS PAGE结果显示 :组成型转化子于培养 4d后AS的表达水平已达到高峰 ,分泌量为 5 8mg/L ;而诱导型转化子诱导 4d后表达的AS仅是组成型表达的 70 % ,诱导 6d后达到高峰 ,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时 (4d)的 86 %。CAM分析和抗癌实验结果显示 :P .pastorisGS115 (pGAP9K AS)和P .pastorisGS115 (pPIC9K AS)表达的AS均具有抑制血管生成和C5 7BL/ 6J实验小鼠的B16黑色素瘤的生长 ,其平均瘤重抑制率分别达到 90 6 1%和 90 5 4 %。以上结果表明 ,以GAP启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点 ,PGAP可以取代PAOX1在P .pastoris中表达AS及其他外源蛋白。