黑曲霉mRNA的分离及其cDNA的合成和克隆

采用酚一蛋白酶K抽提和氯化锂沉淀法,从10g黑曲霉细胞中获得8mg总RNA,经二次寡聚(dT)-纤维素亲和层析纯化得60μg poly(A)^+mRNA。经紫外分光,6M尿素—琼脂糖凝胶电泳分析及体外翻译试验结果证明:纯化的poly(A)^+mRNA的纯度及完整性好,无降解并具翻译活性。以纯化的poly(A)^+mRWA为模板,以寡聚(dT)_(12-18)及随机的寡聚核苷酸为引物,用AMV反向转录酶合成了第一链cDNA。用RNaseH及DNA聚合酶Ⅰ水解模板mRNA并合成双链cDNA。第一链及第二链cDNA合成的产率分别为25.8％及96％。合成的cDNA的长度在200～5000bp之间与纯化的poly(A)^+mRNA的长度相等。合成的双链cDNA,经酚-氯仿抽提及2M醋酸钠-乙醇沉淀,除去游离的核苷酸后与EcoRI接头连接,再经EcoRI消化后与λgt10DNA连接,然后进行体外包装,包装物感染大肠杆菌BNN93及BNN102。λgt10及重组的λgt10都能在大肠杆菌BNN93上长出噬菌斑,而只有重组的噬菌体才能在BNN102上长出噬菌斑,按此法筛选,每μgcDNA可获得8×10~4个重组噬菌体。