论应用多基因转化策略综合改良生物体遗传性研究方向的前景 Ⅱ.多基因转化策略中的规律、前景和问题

随着后基因组时代的到来,人类将克隆到越来越多的、生物学意义明确的有用基因应用于基因工程对生物体的遗传改良中。但生物体的绝大多数性状和生理功能都是依靠多基因的协调表达而实现的。因此,多基因转化策略必将成为今后基因工程在基础理论与实际应用研究中的主流方向。综述了近年来中山大学生物工程研究中心//基因工程教育部重点实验室在多基因改良农作物方面的研究工作和进展,分析了多基因转化中的基本规律和存在的问题,最后对多基因转化策略在未来的应用前景作出了简要的展望。

论应用多基因转化策略综合改良生物体遗传性研究方向的前景 Ⅰ .多基因转化的基因来源与技术平台

随着后基因组时代的到来,人类将克隆到越来越多的、生物学意义明确的有用基因应用于基因工程对生物体的遗传改良中。但生物体的绝大多数性状和生理功能都是依靠多基因的协调表达而实现的。因此,多基因转化策略必将成为今后基因工程在基础理论与实际应用研究中的主流方向。结合中山大学生物工程研究中心∥基因工程教育部重点实验室10多年来研究工作的实践体会,对发展多基因转化策略的意义和由来、多基因转化可用的基因资源和技术思路,进行了详细的论述。

展望21世纪的农业生物技术——后基因组时代的农业生物技术

概括地论述了20世纪农业生物技术发展所依托的理论和技术,并对上世纪在较短时间内建立和发展起来的农业生物技术进行了综合评述。作者认为:21世纪的农业生物技术将以后基因组时代为特征而获得巨大的发展;作者还全面展望了在后基因组时代的新世纪中,农业生物技术将取得的革命性的成就、应注意的问题和应创建和具备的条件。

发现新基因的高效方法——cDNA文库的复性式均一化技术

由复性式均一化技术制作的均一化cDNA文库 (equalizedcDNAlibrary ,normalizedcDNAlibrary)是近年来发展起来的一种获得EST、发现新基因的高效平台。本文就该技术的原理、方法比较、存在问题和展望进行了阐述。

LZ-8基因克隆及其在毕赤酵母中的诱导表达

【目的】从灵芝中克隆LZ-8基因并在毕赤酵母表达系统中诱导表达LZ-8蛋白。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)法从赤灵芝的基因组DNA中扩增LZ-8基因序列,采用电激转化法将pPLZ8-X重组质粒转化到毕赤酵母中,PCR Southernblot法检测酵母是否转化LZ-8基因,十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并银染法观察蛋白在酵母中的差异表达。【结果】PCR Southern blot结果显示LZ-8基因已转化到酵母中;SDS-PAGE胶银染结果提示LZ-8蛋白在酵母中被诱导表达。【结论】免疫调节蛋白基因LZ-8在毕赤酵母表达系统获得了诱导表达。

一种简捷的Southern印迹杂交方法

在综合前人方法的基础上,发展了一种简捷、灵敏、廉价、效果可靠的Southern印迹杂交方案。使用0 4mol LNaOH溶液将琼脂糖凝胶上的DNA在变性的同时转移到尼龙膜上,晾干膜后无需固定就可以直接用于杂交。预杂交液和杂交液选用Church缓冲系统,该缓冲系统中仅需10g LBSA作为封闭剂即可。整个洗膜过程可简化为一种溶液、2～3次洗涤。碱变性及转移后的尼龙膜,也可以用于地高辛(DIG)等非放射性检测系统,并可耐多轮杂交和洗脱。本方法可适用于包括高等植物基因组在内的多种生物材料的DNA检测。

四种植物25S rRNA sarcin/ricin结构域甲基化核苷的分析

应用不同浓度的dNTP逆转录反应,分析了苦瓜、丝瓜、蓖麻和水稻的25S rRNA sarcin/ricin区域中的甲基化核苷,发现了这4种植物25S rRNA的第3 023、2 966和2 962位的腺嘌呤、胸腺嘧啶和腺嘌呤是2’-O-甲基化核苷;在丝瓜和苦瓜25S rRNA的第2 992、2 990位的胞嘧啶和鸟嘌呤是葫芦科植物所特有的两个2’-O-甲基化核苷;第2 944位点的尿嘧啶是苦瓜、丝瓜、蓖麻和水稻的一个碱基甲基化核苷;而且,植物25S rRNA第3 023位甲基化腺嘌呤核苷刚好位于sarcin/ricin结构域的茎环上,与核糖体失活蛋白切割位点相距仅5个核苷酸,而在哺乳动物和酵母的rRNA相同位点上没有甲基化修饰的存在,根据这一结果推测,RIPs来源植物核糖体RNA的自我保护可能与这一位点的修饰有关。

利用四价抗病基因提高超级杂交稻的抗性

以籼型超级杂交稻(Oryza sativaL.subsp.indica)恢复系9311的胚性愈伤组织为受体,采用改良的基因枪轰击法将构建在同一植物表达载体上的四价抗真菌病基因(RCH10,RAC22,β-Glu和B-RIP)导入到9311的基因组中.Southern印迹杂交结果表明,潮霉素抗性再生植株中,hpt标记基因和四价抗真菌病基因是连锁在一起并以孟德尔遗传方式进行传递的.部分转基因R1代和R2代植株分别在烟溪和三亚的典型稻瘟病鉴定圃中表现出对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea(Hebert) Barr.)的高抗性.在高抗的转基因植株中,多个外源基因均能正常表达.将高抗稻瘟病的9311R2代转基因纯系与培矮64S原种进行杂交,杂种F1代除对稻瘟病仍可表现出高抗性外,还同时表现出对稻曲病和黑粉病明显提高的抗性.