昆虫病原线虫共生菌BP品系杀虫毒素基因簇中各基因与杀虫活性的关系

昆虫病原线虫共生菌XenorhabdusnematophilusBP的多个杀虫毒素基因集中在一起形成一个约 40kb的基因簇。为研究这个基因簇中各基因与杀虫活性的关系 ,对该共生菌粘粒文库中 5个粘粒克隆XnBP76、XnBP83、XnBP2 0 3、XnBPp378和XnBP41 4及XnBP83的 3个亚克隆插入DNA片段的基因结构和它们对棉铃虫的杀虫活性进行了比较 ,结果显示 ,xptB1 ,xptC1和xptA2 3个基因或后两者的联合表达产物具有最强的杀虫效果 ,缺失其中的任何 1个或 2个会使杀虫活力大幅度地下降或完全消失 ;而xptD1和xptA1的缺失对毒素基因簇的表达产物的杀虫活力影响很小 ;杀虫毒素的物理混合没有明显的增效作用。

t-PA昆虫细胞表达及特性分析

应用RT-PCR技术,从人黑色素瘤Bowes细胞株中扩增出人组织型纤溶酶原激活剂(tis-sue-type plasminogen activator,t-PA)cD-NA。序列分析证实,与国外的报道完全一致。将含完整阅读框架的人t-PA cDNA克隆至昆虫细胞表达转移载体pBacPAK8中,获得重组质粒pBac-tPA。应用脂质体共转染法,将pBac-tPA和线性化杆状病毒BacPAK6 DNA共转染Tn-5B-1昆虫细胞。经空斑筛选获得11株重组病毒。经PCR鉴定与生物活性测定,获得一株高效表达t-PA的重组病毒BactPA3。在含胎牛血清的培养基中,t-PA表达活性在感染(MOI≈10)后72h左右达到最高,为3.04×10~3IU/ml,即相当于1.8×10~4IU/10~6细胞;在无血清培养基中,t-PA最高表达水平相差不大,但时间为感染后132h左右。经SDS-PAGE纤维蛋白自显影分析,分子量为68kDa左右。与从人黑色素瘤细胞培养液中提纯的天然t-PA相比,其受纤维蛋白原激活的特性、和纤维蛋白的亲和力及在血浆中的失活速率基本相同。表达的t-PA在血液循环中的半衰期为7min。

昆虫病原线虫共生菌BP品系杀虫毒素基因xptA2的杀虫活性分析

为进一步研究嗜线虫致病杆菌 Xenorhabdus nematophila 杀虫毒素基因簇中各基因的功能,从BP 品系的粘粒文库中筛选出一个粘粒克隆 XnBP83包含全部的 xpt 基因,对该粘粒克隆进一步亚克隆得到一个亚克隆菌株 Sub9.0,只有一个 xpt 基因 xptA2。以 Sub9.0为研究对象,对 xptA2的功能作了进一步研究。结果表明,xptA2基因的表达产物与其它 xpt 基因的表达产物物理混合后无明显增效作用,而将 xptA2转入缺失 xptA2的粘粒克隆 XnBP76和 XnBP203后,也同样无明显增效作用。对 xptA2的序列分析发现,BP 品系的 xptA2预测氨基酸序列与已发表序列相比明显存在2个变异区。进一步 BLAST 分析发现,这2个变异区同昆虫病原线虫共生菌中与口服毒性有关的杀虫毒素蛋白具有同源性。