心肌细胞凋亡在心脏外科中的意义

通过细胞凋亡的大量研究,使人们对许多疾病的认识增加了新的视角。心肌细胞凋亡参与了多种心血管疾病的病理生理过程,缺血再灌注损伤造成心肌细胞凋亡。心肌细胞凋亡是心脏术后心肌顿抑的重要机制,减少心肌细胞凋亡是心肌保护的一重要方向。

体外培养鼠骨髓间充质干细胞及其向心肌样细胞诱导分化的实验研究

目的通过体外培养骨髓间充质干细胞(MSCs),并用5-氮胞苷诱导其向心肌样细胞分化,研究MSCs生物学特性和5-氮胞苷效能。方法将SD大鼠的骨髓采用贴壁法进行分离培养及传代增殖,相差显微镜下观察细胞形态变化,绘制生长曲线,并用流式细胞仪技术检测CD29、CD45的表达,进行细胞成分鉴定。用5-氮胞苷体外诱导MSCs,观察其形态结构。用免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)、结蛋白(Desmin),用RT-PCR检测心肌特异因子基因β-肌球蛋白重链(β-MHC)的表达。结果贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖较快。经5-氮胞苷诱导后,MSCs形态发生变化,可见肌管样结构。免疫组化和RT-PCR证实MSCs经体外诱导发生了向心肌样细胞的分化。结论采用贴壁筛选法,简便易行,短期内可获得大量的纯度较高的骨髓间充质干细胞;在5-氮胞苷的诱导下,骨髓间充质干细胞呈现向心肌样细胞分化的趋势。

转染抗凋亡bcl-xL基因抗大鼠急性缺血心肌细胞凋亡

目的:探讨抗凋亡基因bcl-xL治疗大鼠急性心肌梗死的可行性。方法:实验于2004-02/2005-02在中山大学第二附属医院医学实验中心完成。建立大鼠急性心肌梗死模型,大鼠随机分为实验组和对照组各10只,实验组用腺病毒介导的方法将bcl-xL基因导入急性缺血大鼠的心肌,对照组仅用生理盐水代替;用免疫组化法半定量分析显示大鼠心肌抗凋亡基因bcl-xL蛋白表达水平,采用缺口末端标记技术和流式细胞仪评估大鼠心肌细胞是否发生凋亡及凋亡的程度。结果:16只大鼠进入结果分析。①4周后取心脏梗死区标本免疫组化检测bcl-xL蛋白表达,发现对照组心肌只有少数着色,而实验组的心肌组织大多数呈深棕色。半定量分析显示,实验组的心肌组织内bcl-xL蛋白表达阳性单位值明显高于对照组(19.66±4.62,8.89±2.16,t=-5.98,P<0.01)。②两组心肌组织中均检测到缺口末端标记技术阳性染色的凋亡细胞。③显微镜下计数,对照组心肌细胞凋亡指数明显高于实验组犤(18.19±4.15)%,(7.25±2.09)%,t=6.65,P<0.01犦。④流式细胞仪检测结果为实验组心肌缺血后转染bcl-xL基因细胞凋亡率为(6.79±1.98)%,而对照组的细胞凋亡率为(20.15±6.04)%,实验组出现明显低于对照组的凋亡峰。结论:转染bcl-xL基因后在心肌组织内有高效的bcl-xL蛋白表达,心肌细胞凋亡指数明显减少,流式细胞仪检测到的细胞凋亡峰明显降低,而未转染bcl-xL基因的心肌细胞因缺血缺氧出现大量的凋亡细胞,细胞凋亡峰显著增高,表明心肌细胞通过转染bcl-xL基因,虽然没有完全阻断细胞凋亡,但大大提高了抗凋亡能力。同时心肌细胞的抗缺血、缺氧和抗损伤能力明显增强,提示转染bcl-xL基因通过其抗凋亡作用能明显提高心肌细胞在缺氧条件下的生存能力。

穿孔素、粒酶B、Fas、Fas-L和Caspase 3在心肌细胞凋亡中的作用和相互关系

目的探讨小鼠移植心脏组织中穿孔素、粒酶B、Fas、Fas-LmRNA以及活性Caspase3的表达和水平变化,以了解它们在急性排斥反应心肌细胞凋亡中的作用和相互关系。方法利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术、Western免疫印迹(WesternBlot)等检测方法,检测了与凋亡发生机理有关的穿孔素、粒酶B、Fas、Fas-LmRNA及活性Caspase3蛋白的表达和变化。同时,通过组织学分析和TDT介导的原位末端标志(TUNEL)等检测方法,分析了小鼠心脏移植模型急性排斥反应时组织损伤和细胞凋亡的情况。结果Fas在同基因组和异基因组中均有表达,且水平无差异。但Fas-L、穿孔素、粒酶B及Caspase3只在异基因小鼠心脏移植中出现,术后第1天都开始表达,术后3d、5d强烈上调,与组织损伤、细胞凋亡呈直接相关。当使用Caspase抑制剂后,Caspase3活性随之明显降低(P<0·01),相应地组织损伤和细胞凋亡指数(AI)也明显减轻(P<0·01)。但其穿孔素、粒酶B、Fas-L却无变化。结论小鼠心脏移植急性排斥反应过程中存在心肌细胞的凋亡,是其损伤的重要机制;FasL、穿孔素、粒酶B以及活化Caspase3的出现和上调程度与凋亡细胞的数量与急性排斥反应的严重程度直接相关;由细胞毒T淋巴细胞引发的Fas/FasL、粒酶B/穿孔素两种途径介导的细胞凋亡,都必须经过Caspase3的活化这一共同通道来完成。

小鼠梗死心肌组织上VEGF基因治疗和骨髓间充质干细胞移植的实验研究

目的探讨VEGF基因治疗和MSCs移植各对梗死心肌组织的影响。方法将相同基因背景的SD雄性大鼠30只随机分成A、B、C三组。建立心肌梗死模型后,MSCs组注射MSCs 4×106cells/50μl。AdVEGF组注射AdVEGF 5×107pfu 50μl。Control组(对照组)注射无血清IMDM培养液50μl。移植前、移植后2、4周分别用超声检测心功能。病理中检测细胞存活分化和血管新生情况。结果MSCs组移植2、4周后AdVEGF组与Control组相比,心功能较移植前有明显改善(P<0.01),而且病理提示大部分MSCs己向心肌样细胞分化。MSCs组和AdVEGF组都有促血管新生作用,MSCs组为(5.94±1.67)mm;AdVEGF组(13.59±1.08)mm,Control组(对照组)无新生血管出现。结论移植于梗死心肌的骨髓间充质干细胞可以存活,并在一定程度上改善了受体的心功能。