人脐静脉内皮细胞外泌体对糖尿病兔创面愈合的作用及其机制

目的探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)外泌体对糖尿病兔创面愈合的作用及其机制。方法采用实验研究方法。取中南大学湘雅三医院2019年6月收治的2例糖尿病溃疡患者(男49岁、女58岁)手术切除溃疡周边皮肤组织,提取原代血管内皮细胞(VEC)和人皮肤成纤维细胞(HSF),通过形态观察和流式细胞术成功鉴定。采用超速离心法提取HUVEC外泌体,通过形态观察、粒径检测和蛋白质印迹法检测成功鉴定。取20只3个月龄雌性新西兰兔,背部两侧分别制作1个2型糖尿病全层皮肤缺损创面,将创面分成外泌体组和磷酸盐缓冲液(PBS)组并进行相应处理,每组20个创面,观察创面组织完全覆盖时间。伤后14 d,行苏木精-伊红染色或Masson染色,观察血管生成或胶原纤维增生情况(样本数为20)。观察VEC和HSF与HUVEC外泌体共培养24 h对HUVEC外泌体的摄取情况。将VEC与HSF均分成采用HUVEC外泌体或PBS处理的外泌体组和PBS组,采用细胞计数试剂盒8检测培养4 d细胞增殖情况,采用划痕试验检测并计算划痕后24、48 h细胞迁移率,采用Transwell实验检测培养24 h细胞迁移数,采用实时荧光定量反转录PCR法检测核因子红细胞系2相关因子2(NRF2)、转录激活因子3(ATF3)的mRNA表达,行成管实验观测VEC培养12 h血管分支点数和成管长度(样本数均为3)。取VEC及HSF,分成同前处理的PBS组、外泌体组和采用相应基因干扰的NRF2干扰组、ATF3干扰组、空载干扰组,同前检测2种细胞增殖、迁移和VEC的血管形成(样本数均为3)。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、独立样本t检验及LSD检验。结果外泌体组创面组织完全覆盖时间为(17.9±1.9)d,明显短于PBS组的(25.2±2.3)d,t=4.54,P<0.05。伤后14 d,PBS组创面血管密度明显低于外泌体组(t=10.12,P<0.01),胶原纤维生成少于外泌体组。培养24 h,HUVEC外泌体成功被VEC和HSF摄取。培养4 d,外泌体组HSF和VEC增殖活力均明显强于PBS组(t值分别为54.73、7.05,P<0.01)。划痕后24、48 h,外泌体组HSF迁移率(t值分别为3.42、11.87,P<0.05或P<0.01)和VEC迁移率(t值分别为21.42、5.49,P<0.05或P<0.01)均明显高于PBS组。培养24 h,外泌体组VEC、HSF迁移数均明显多于PBS组(t值分别为12.31、16.78,P<0.01)。培养12 h,外泌体组HSF和VEC中NRF2的mRNA表达均明显高于PBS组(t值分别为7.52、5.78,P<0.05或P<0.01),ATF3的mRNA表达均明显低于PBS组(t值分别为13.44、8.99,P<0.01)。培养12 h,外泌体组VEC血管分支点数明显多于PBS组(t=17.60,P<0.01),成管长度明显长于PBS组(t=77.30,P<0.01)。培养4 d,NRF2干扰组HSF和VEC增殖活力均较PBS组和外泌体组显著降低(P<0.05或P<0.01);ATF3干扰组HSF和VEC增殖活力均较PBS组显著增加(P<0.05或P<0.01),均较外泌体组显著降低(P<0.05或P<0.01)。划痕后24、48 h,ATF3干扰组HSF和VEC的迁移率均较PBS组显著增加(P<0.05或P<0.01),均较外泌体组显著降低(P<0.05或P<0.01)。划痕后24、48 h,NRF2干扰组HSF和VEC的迁移率均较PBS组和外泌体组显著降低(P<0.05或P<0.01)。培养24 h,ATF3干扰组VEC和HSF的迁移数均明显多于PBS组(P<0.05),均明显少于外泌体组(P<0.05或P<0.01);NRF2干扰组VEC和HSF的迁移数均明显少于PBS组和外泌体组(P<0.01)。培养12 h,NRF2干扰组VEC血管长度、分支点数均较PBS组和外泌体组明显减少(P<0.01);ATF3干扰组VEC血管长度、分支点数均较PBS组明显增加(P<0.01),均较外泌体组明显减少(P<0.01)。结论HUVEC外泌体通过促进VEC和HSF的增殖、迁移,从而促进糖尿病兔创面愈合,而NRF2和ATF3在这个过程中明显受到外泌体的影响,是外泌体作用的可能靶点。