生物技术在现代药学综合实验中的应用与思考

为了推动实验教学改革,培养现代医学人才,中山大学药学院将现代生物技术中的微生物技术、分子生物学技术,蛋白纯化技术,免疫学技术等结合在一起,通过开设《现代药学生物技术综合大实验》课程,不断完善实验教学,为提高学生综合素质,开发学生创造性思维提供了大量宝贵经验,是一项值得大力推广的教学模式。

自体富血小板血浆促进兔上颌缝牵张成骨的实验研究

目的:探讨自体富血小板血浆对兔上颌骨牵张成骨的影响。方法:将16只年轻健康家兔随机分为1周实验组(4只),1周对照组(4只),3周实验组(4只),3周对照组(4只)。分别在家兔左侧前颌缝的两侧置入钛钉(直径1.5mm),戴自制前牵引装置,1周实验组和1周对照组持续牵引1周,3周实验组和3周对照组持续牵引3周。试验组在牵张开始时将制得的富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)与10%氯华钙、牛凝血酶以9∶1(v/v)比例混合,形成凝胶样物质注射至左侧前颌缝内。牵引结束后对骨缝两侧钛钉间距离的增加值以及组织学等指标进行观察以及相关统计学分析。结果:对照组试验组家兔上颌均向前移位。同对照组相比,实验组骨缝标志钉间距离增加值较大,新骨生成与矿化较快,血管分布较多,牵张间隙中骨小梁较为粗壮和成熟。结论:富血小板血浆有助于骨组织再生,对兔上颌骨牵张具有促进作用。

两种不同被动式自锁托槽摩擦力的实验研究

目的:探讨2种被动式自锁托槽系统(SmartClip,Damon3)分别和不同弓丝组合时在后牙段所产生的摩擦力差异。方法:24℃及干燥条件下,分别测试这2种被动自锁托槽系统与3种弓丝(0.36mm NiTi圆丝、0.48mm×0.64mmN iTi方丝、0.48mm×0.64mm不锈钢方丝)组合时在后牙段的动、静摩擦力。结果:当使用0.36mm NiTi圆丝时,SmartClip与Damon3自锁托槽的摩擦力相比无显著差异(P>0.05)。当使用0.48mm×0.64mm NiTi方丝和不锈钢方丝时,SmartClip与Damon3自锁托槽的摩擦力相比差异有显著性(P<0.05),并且SmartClip大于Damon3自锁托槽的摩擦力。结论:SmartClip自锁托槽可以有效调节摩擦力大小,在使用较小尺寸弓丝时可达到同Damon3自锁托槽相似的低摩擦力效果,当放入0.48mm×0.64mm以上的方丝时摩擦力迅速增加。

雷帕霉素对肝癌肝移植术后复发影响的实验研究

【目的】探讨雷帕霉素对肝癌肝移植术后复发影响。【方法】应用MTT细胞增殖实验观察雷帕霉素对walker-256肿瘤细胞增殖的影响;应用流式细胞仪观察雷帕霉素对walker-256肿瘤细胞周期的影响;应用荧光定量RT-PCR观察雷帕霉素walker-256肿瘤细胞VEGFmRNA表达的影响。观察雷帕霉素对免疫抑制肝转移癌大鼠模型肿瘤生长情况、肿瘤组织PCNA指数、肿瘤复发率及生存情况的影响。【结果】MTT细胞增殖实验示雷帕霉素对walker-256肿瘤细胞有抑制作用,IC50为9.60ng/mL;细胞周期检测示雷帕霉素组G1/G0期比例为55.2%±0.1%较对照组(45.2%±0.4%)高(P<0.05);雷帕霉素组VEGFmRNA表达为(4.50±0.13)×10-2较对照组[(70.8±1.3)×10-2]低(P<0.05)。雷帕霉素组荷瘤大鼠荷瘤肝重为(12.5±0.2)g,较对照组[(14.4±0.3)g]轻,两组间差别有统计学意义(P<0.05);雷帕霉素组荷瘤大鼠荷瘤肝质量比为(61.3±0.6)×10-3,较对照组[(70.8±1.3)×10-3]小,两组间差别有统计学意义(P<0.05);雷帕霉素组大鼠肿瘤复发率为90%,对照组为95%,两组比较差异无统计学意义;雷帕霉素组生存时间为(26.5±2.5)d,对照组为(14.8±2.3)d,两组间差别有统计学意义(P<0.05)。雷帕霉素组大鼠PCNA指数为64.1%±2.1%,较对照组(80.8%±1.0%)低,差别有统计学意义(P<0.05)。【结论】虽然雷帕霉素对降低免疫抑制下的肿瘤复发率作用不明显,但能明显抑制肿瘤生长速度,延长带瘤生存时间。

肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立

【目的】制备TRE-HCV-C转基因小鼠,为四环素调控系统的体内研究提供了反应部分的转基因小鼠,以便与本实验室同时建立的调控部分的小鼠共同作用,为进一步建立双转基因小鼠模型奠定基础,更为丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)的发病机制的研究提供一个实用方便的模型。【方法】重组构建含有目的基因HCV-C、TRE序列和SV40 polyA的转基因载体pTRE-HCV-C,以显微注射的方法将1.153kb的转基因片段注入BALB/C母鼠的受精卵,出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性,再经Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定。用转基因阳性小鼠和整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的另一品系转基因小鼠杂交,得到子代F1小鼠,通过免疫组织化学来初步检测HCV-C在肝脏中特异性的可调控性的表达。【结果】产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首建鼠,以及它的子代也带有此基因。与基因组上整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的转基因小鼠杂交后,得到子代F1小鼠,特定时间与DOX作用后,小鼠肝脏的免疫组织化学结果表明,TRE-HCV-C小鼠为丙型肝炎病毒核心蛋白的发病机制研究提供了一个良好的动物模型工具。【结论】成功制备了HCV-C转基因小鼠,可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用,为进一步建立四环素调控系统调控下表达HCV-C基因双转基因小鼠模型奠定基础,也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。

小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为精原干细胞的研究

目的:初步探讨在体外条件下诱导小鼠胚胎干细胞(EGFP-mESC)分化为精原干细胞(SSC)的条件,建立有效的技术平台。方法:采用部分模拟胚胎早期发育的方法,将EGFP-mESC(XY)经体外悬滴培养,制备拟胚体(EB);使用免疫磁珠分选法从EB中分离出表达原始生殖细胞(PGC)表面标志SSEA-1的细胞;获得的细胞经2μmol/L维甲酸(RA)诱导增殖,使之向雄性生殖细胞分化。对诱导的细胞采用RT-PCR及免疫荧光检测特异性基因及蛋白的碱性磷酸酶。结果:在诱导EGFP-mESC向雄性生殖细胞分化的过程中,采用RT-PCR方法检测到了雄性生殖细胞特异表达基因Sry、fragilis、stella、Tex14等mRNA的表达;利用激光共聚焦方法检测到SSC表面标志蛋白Stra8、integrin-α6及Hsp90α的表达。结论:采用RA体外诱导EGFP-mESC定向分化为SSC是可行的。

外源EGFP基因在肿瘤细胞中的稳定表达

通过将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染到人肺腺癌细胞(A549)内,建立以EGFP为探针的体外抗癌药物细胞株。使用电穿孔法导入EGFP基因到A549细胞;然后用G418筛选以及梯度稀释法筛选出EGFP高度表达的细胞株。初步建立稳定表达绿色荧光蛋白的人肺癌细胞株。

不同粒径的介孔纳米硅材料皮下给予小鼠的急性毒性

目的研究介孔纳米硅材料(MSN)经皮下注射对小鼠的急性毒性,分析异常反应与材料粒径的关系,探讨诱发局部刺激及全身毒性的相关机制。方法昆明小鼠一次性sc给予MSN 1000 mg·kg-1的3种不同颗粒(80,200,1000 nm)和粒径约20 nm的二氧化硅纳米粉末(NP)。14 d后取血进行血液学检测,称重并计算心、肝、脾、肺和肾脏器系数,制片并进行病理组织学检查。结果 80 nm和1000 nm的MSN和NP会导致小鼠皮下出现肉眼可见的肿块,出现肿块的时间顺序和严重程度为20 nm NP>1000 nm>80 nm。此外,其均会不同程度地诱发小鼠皮下注射部位纤维组织增生和炎症细胞浸润,并引起肝细胞水肿和脾生发中心变大等,血液中白细胞和血小板量均显著性地增加(P<0.05)。200 nm的MSN未导致动物出现皮损,且病理观察和血液学指标的异常程度均低于其他给药组。结论皮下注射不同粒径的MSN会导致小鼠产生刺激性毒性,并且这种毒性与颗粒粒径相关,皮下刺激毒性的严重程度为20 nm NP>1000 nm>80 nm>200 nm。

牛胚胎干细胞建系的现状与展望

胚胎干细胞是能在体外培养中保持自我更新和多分化潜能的细胞。因此,牛胚胎干细胞系是基因工程、治疗性克隆、发育生物学、人类疾病动物模型研究的良好实验载体。公认的胚胎干细胞系已在小鼠和灵长类动物中建立。虽然关于牛类胚胎干细胞的报道也已有不少,但是真正的牛胚胎干细胞建系尚未获得成功。本文将综述当前牛胚胎干细胞建系的研究进展并对其中存在的问题,如胚胎分离胎龄、牛胚胎干细胞识别与鉴定、培养条件和与分化相关细胞因子和信号通路等,进行探讨并提出可能采取的解决办法。