非小细胞肺癌中EGFR基因突变与ERCC1、Ki-67表达及临床病理特征的关系

目的探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中EGFR基因突变与切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementation group 1,ERCC1)、Ki-67蛋白表达及其临床意义。方法采用DNA测序法检测EGFR基因突变,免疫组化En Vision法检测ERCC1、Ki-67蛋白表达,分析与临床病理特征的关系。结果 EGFR基因突变率为49.1%(143/291),多见于女性、不吸烟、腺癌患者。EGFR基因突变在腺癌的不同亚型中差异有显著性(P=0.008);EGFR基因突变组肿瘤直径的中位数小于野生型组(P=0.020);EGFR基因突变与患者年龄、淋巴结有无癌转移无相关性(P>0.050);鳞状细胞癌中ERCC1阳性率高于腺癌(P=0.039)。Ki-67表达与肺癌分化程度有关,低分化高于高、中分化(P=0.010);ERCC1、Ki-67表达与EGFR基因突变无相关性(P>0.050)。结论 EGFR基因突变与NSCLC患者性别、组织学类型、分化程度等相关,存在多种突变。EGFR基因突变与ERCC1、Ki-67表达无相关性。

实时荧光定量PCR检测乳腺癌5种多药耐药基因的表达强度

目的 :检测 5种多药耐药基因在乳腺癌细胞株 MCF- 7和 MCF- 7/ADR里的表达强度变化 ,为乳腺癌多药耐药逆转研究提供新的思路。方法 :通过实时荧光定量 PCR技术分别检测乳腺癌敏感细胞株 MCF- 7和耐药细胞株 MCF- 7/ADR里的 mdr1、MRP、L RP、GST- π、TOPO α基因表达强度。结果 :MCF- 7/ADR里的 mdr1、MRP、LRP、GST- π基因表达强度分别比它们在 MCF- 7里的表达强度相对增加了 1 2 5 .39、5 5 .5 3、1 .2 4、3.38倍 ,TOPO α则降低了 0 .43倍 ,其中 mdr1、MRP表达强度的相对增加倍数均显著高于 L RP、GST- π、TOPO α的增加 (或降低 )倍数 ( P<0 .0 0 1 )。结论 :除了 mdr1之外 ,MRP也可能在乳腺癌的多药耐药产生机制里起重要作用。因此

免疫抑制剂代谢相关基因多态性检测芯片的研制及其在肝移植患者中的应用

目的建立一种快速、准确的检测免疫抑制剂常见代谢相关基因多态性的微阵列芯片技术,明确肝移植供、受体细胞色素P450家族细胞色素3A5(cytochrome P4503A5,CYP3A5)及多药耐药1(multidrug resistance1,MDR1)基因多态性对术后患者他克莫司(FK506)浓度/剂量比(C/D)的影响。方法选取CYP3A5和MDR1基因外显子的8个常见变异基因位点(CYP3A5Exon1、Exon2、Exon3、Exon13和MDR1Exon1、Exon12、Exon21、Exon26)设计特异性野生型、突变型引物检测探针,通过AD3200微阵列芯片点样仪点样于醛基基片上,室温保湿过夜固定。采用该基因芯片对109份肝移植供、受者全血标本进行检测,每份样本重复检测3次,GenePix4100共聚焦扫描仪阅读芯片,GenePixPro410芯片图像分析软件分析结果,根据同一检测位点野生型探针和突变型探针在阴阳性状态的信号值比值来确定探针的切值(cut-off值)。引物探针和样本微阵列芯片检测结果与脱氧核糖核酸(DNA)测序作比对进行验证。进一步分析临床资料完整的32例肝移植患者,比较供、受体CYP3A5和MDR1基因多态性对患者FK506C/D值的影响。结果芯片样点分布均匀、清晰、规整度好、无漏点和连点,突变型探针和野生型探针的荧光信号强度区分明显;按照突变型探针和野生型探针的荧光强度比值设定cut-off值,结果易于判断,芯片检测结果与测序结果符合率高达99%。供体CYP3A5基因Exon3第6986位点A/G单核苷酸多态性(CYP3A5*3)与FK506C/D值有关,术后2、4、12周供体CYP3A5*1/*1和*1/*3型患者的FK506C/D值明显低于*3/*3型患者(均为P<0.05),而供、受体CYP3A5其它基因型及供受体MDR1各基因型组间FK506C/D值相比差异无统计学意义(均为P>0.05)。结论供体CYP3A5基因第6986位点携带*1等位基因的患者需更高剂量FK506才能达到目标血药浓度。CYP3A5和MDR1基因多态性的微阵列芯片技术的检测效果理想,可重复性强,为肝移植术后免疫抑制剂的个体化用药提供可靠的参考指标。

先天性心脏病患儿体内人巨细胞病毒糖蛋白B基因型研究

目的探讨HCMV感染和gB基因型与先天性心脏病关系。方法2004年9月～2005年6月住院的先天性心脏病患者116人为先心组,其中仅患先天性心脏病者73人,合并肺炎43人,其中男性64人,女性52人,年龄1个月～13岁,平均(1.7±2.0)岁。对照Ⅰ组为同期住院无先天性心脏病而仅患肺炎的患者98人,其中男性57人,女性41人,年龄1个月～14岁,平均(2.3±3.3)岁。对照Ⅱ组为无症状正常婴儿但尿HCMV—DNA检测为阳性,共25人,年龄1个月～12月,平均(6.9±5.3)月。应用荧光定量法检测先心组和对照Ⅰ组尿HCMV—DNA含量,应用套式PCR(nPCR)加限制性长度多态性分析(RFLP)的方法检测HCMV包膜糖蛋白B(glycoprotein B,gB)基因型。结果先心组尿HCMV—DNA阳性率60.3%,对照Ⅰ组尿HCMV—DNA阳性率36.7%,差异有统计学意义(X^2=11.864,P<0.01);年龄1～12月先心患儿体内HCMV gBⅠ型占78.6%(22/28),对照Ⅱ组HCMV gBⅠ型占40.0%(10/25),差异有统计学意义(X^2=8.214,P<0.01)。结论宫内HCMV感染可能是先天性心脏病的致畸因子,gBⅠ型是致病优势基因。

3种白血病细胞株中P73、DAPK、O^6 MGMT和CDH1基因启动子区CpG岛甲基化模式分析

目的分析3种白血病细胞株中P73、DAPK、O6MGMT和CDH1基因启动子区Cp G岛甲基化模式。方法运用亚硫酸氢盐测序法分析P73、DAPK、O6MGMT和CDH1抑癌基因启动子区Cp G岛在健康人外周血白细胞(正常对照)和U937、HL-60及Jurkat白血病细胞株中甲基化状态,绘制其甲基化图谱,并应用甲基化特异性PCR法在不同细胞中进行验证。结果正常对照、U937、HL-60及Jurkat基因组甲基化率分别为7.26%(238/3 279)、61.33%(1 813/2 956)、89.35%(3 090/3458)、58.10%(1 342/2 310),白血病细胞株与正常对照比较,P均<0.01。P73基因可鉴别正常细胞和肿瘤细胞,DAPK基因可区分开肿瘤细胞HL-60、U937及Jurkat,O6MGMT可进一步把U937与Jurkat区分开。结论 P73、DAPK、O6MGMT和CDH1基因具有特异的甲基化模式,通过3次MSP检测能将正常细胞和白血病细胞株进行鉴别。

双位点保守基因特异性PCR-CE-RFLP快速鉴定病原菌的实验与临床研究

[目的]初步建立一个临床常见病原菌的标准PCR-CE-RFLP数据库,为临床快速鉴定病原菌奠定基础。[方法]选取临床分离的病原菌共167株,筛选16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因的合适引物,分别用FAM和JOE两种荧光素标记,调整PCR反应条件,让两种引物能同时在同一条件下反应,所得产物先用普通琼脂糖凝胶电泳,再分别用限制性内切酶HaeIII进行不完全酶切,酶切产物50倍稀释后进行毛细管电泳(PCR-CE-RFLP),测定酶切片段长度差异。[结果]针对16S rRNA基因的RFLP谱数据只能将病原菌鉴定到"科"的程度,而单纯应用16S-23S rRNA间区基因的RFLP谱数据虽能区分绝大多数细菌,但个别种属内仍然出现相似的谱型。经过双位点PCR-CE-RFLP分析后,则可将所有细菌鉴定到"种"的程度。[结论]利用16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因PCR-CE-RFLP进行细菌鉴定简便快捷,能将传统方法需要十几个小时甚至几十小时的鉴定工作缩短到几个小时,是一种极有临床应用价值的快速诊断方法。

用荧光定量PCR检测46,XY女性的SRY基因

目的:探讨用荧光定量聚合酶(FQ-PCR)检测46,XY女性SRY基因的可靠性和临床意义。方法:应用FQ-PCR方法对10例46,XY女性患者进行了SRY基因检测,并将检测结果与剖腹探查及病理组织学结果比较。结果:10例患者中,有8例SRY基因阳性,定量结果为(2～5)×108拷贝/mL,与正常男性SRY基因的拷贝数相近,8例体内均无卵巢组织,6例有发育不良的睾丸组织,2例卵巢部位为曲细精管组织;2例SRY基因阴性,体内有未发育的卵巢组织和幼稚子宫,无睾丸组织。结论:用FQ-PCR法检测SRY基因是可靠的,该方法可为患者的临床诊断、治疗提供进一步的依据。

龟板含药血清促进骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白4的表达

目的龟板有促大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖作用,本研究观察龟板含药血清对MSCs中骨形态发生蛋白4(BMP4)表达的影响。方法使用密度梯度法分离大鼠骨髓间充质干细胞进行培养,传代纯化,在基础培养液中添加不同浓度龟板含药血清和对照血清,用荧光定量PCR和原位杂交方法检测BMP4 mRNA表达,用ELISA、免疫组织化学和免疫荧光组织化学法结合激光扫描共聚焦显微镜技术检测BMP4蛋白表达的变化。结果BMP4蛋白和mRNA表达相一致,龟板含药血清以浓度依赖方式促进MSC的BMP4 mRNA及其蛋白表达。结论龟板含药血清以时效和量效依赖性促进BMP4在MSCs的表达,可能与龟板促MSCs增殖作用有关。

VEGF mRNA在预测肝癌肝移植术后肿瘤复发和转移中的应用价值

目的探讨血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)mRNA作为肝癌游离癌细胞标志物在预测肝癌肝移植术后复发和转移中的应用价值。方法以2002年4月至2003年12月期间的53例原发性肝癌肝移植患者为研究对象(肝癌肝移植组),通过建立稳定可靠的实时荧光定量RT-PCR检测方法来定量检测肝癌患者外周血中VEGFmRNA在整个肝移植术围手术期的动态变化情况,并与术后复发和转移进行相关分析;同时,为了解VEGFmRNA表达的特异性,分别设立了进展期肝癌组(n=8)、良性肝病组(n=26)和正常对照组(n=10)。结果VEGFmRNA可以作为肝癌游离癌细胞的标志物,具有较好的特异性。进展期肝癌组和肝癌肝移植组VEGFmRNA的表达阳性率明显高于良性肝病组和正常对照组(75.0%、37.7%vs11.5%、10.0%),P<0.01;术前VEGFmRNA的阳性表达和术后出现2次以上持续性的VEGFmRNA阳性表达与移植术后肝癌复发与转移相关(P<0.01)。结论术前检测VEGFmRNA阳性表达和术后持续的VEGFmRNA标志物检测表达阳性可以有效预测肝癌肝移植术后肿瘤复发和转移。

肝癌肝移植患者外周血中AFP mRNA和MXR7 mRNA的表达及其与预后的关系

目的:探讨甲胎蛋白(浕-fetoprotein,AFP)mRNA和米托蒽醌抗性基因(Mitoxantrone-resistant7,MXR7)mRNA作为游离癌细胞(isolated tumor cells,ITC)的标志物在肝癌肝移植患者外周血中的表达情况及其与术后肿瘤复发和转移的关系。方法:以2002年4月至2003年12月期间的53例肝癌肝移植患者为对象,通过建立稳定可靠的实时荧光定量RT-PCR检测方法来定量检测肝癌患者外周血全细胞中AFP mRNA和MXR7mRNA在整个肝移植术围手术期的表达和动态变化情况,并与术后肝癌复发和转移进行相关分析。结果:将研究对象分为肝癌移植组(53例)、晚期肝癌组(8例)、良性肝病组(26例)、正常对照组(10例),检测发现在肝移植术前,晚期肝癌组的AFP mRNA和MXR7mRNA其表达率均达到100%,在肝癌移植组中表达率分别为57.7%和53.6%。2者均明显高于在良性肝病组(表达率为19.2%和0)和正常对照组(表达率均为0)(P<0.05)。同时在2者的阳性结果表达水平上,晚期肝癌组和肝癌组要明显高于良性肝病组和正常对照组(P<0.05),前2者阳性结果定量水平达到1×1012copies/g RNA,是后2者定量水平的100-200倍。围手术期AFP mRNA和MXR7mRNA的表达无论是表达率还是阳性结果表达水平,均以在术中的检测标本为最高,而术后1周为次之。术后出现2次以上的持续性的AFP mRNA和MXR7mRNA的表达往往提示肝癌的复发和转移,较之移植术后没表达或一过性升高的病例,其差异有统计学意义(P<0.05),而术前和术中单次的AFP mRNA和MXR7mRNA的表达与否则对术后肝癌复发和转移无明显影响(P>0.05)。结论:AFP mRNA和MXR7mRNA可以作为肝癌ITC细胞的标志物,具有较好的特异性。术后血全细胞检测出现2次以上的持续性的AFP mRNA和MXR7mRNA的表达可以有效预测肝癌肝移植术后肿瘤复发和转移。

弓形虫感染家兔精液中虫体含量的动态变化

目的检测弓形虫感染家兔精液中虫体DNA,观察虫体在精液中动态变化情况。方法用RH株弓形虫速殖子105个/只的剂量腹腔感染雄性家兔16只。在家兔感染前后分别采集精液,-40℃冻存备用,采用两种方法提取精液中总DNA,用实时定量PCR(quantitativereal-timePCR,QRT-PCR)检测弓形虫感染家兔精液中弓形虫DNA,依据对照计算虫体拷贝量,绘制感染后时间与精液中虫体含量的动态曲线图。结果16只雄兔感染前其精液中均不能检测到弓形虫DNA,精液中虫体含量在感染后7wk左右达到高峰期,然后虫体含量逐渐下降。在感染9wk^15wk维持较低水平。结论弓形虫感染雄兔精液中虫体含量随感染后时间不同而变化。

中国北方地区321例乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者的流行病学和临床特征分析

背景:我国是肝细胞癌(HCC)高发区,其中大部分HCC与乙型肝炎病毒(HBV)感染相关,有必要对其自然史和临床进程作大样本调查研究。目的:了解中国北方地区HBV相关HCC患者的流行病学和临床特征。方法:对中国北方地区321例HBV相关HCC患者作流行病学问卷调查,行肝功能、甲胎蛋白(AFP)、HBV血清标志物和HBV DNA水平检测,并进行统计分析。结果:321例HBV相关HCC患者中,仅7.2%接受过抗病毒治疗;46.4%和25.5%分别有肝硬化和肝癌家族史;38.3%有饮酒史。21.0%的患者乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性,62.3%乙型肝炎e抗体(HBeAb)阳性,HBeAg阳性者合并肝硬化的比例和HBV DNA水平较高。84.5%的患者HBV DNA阳性,但其中仅42.6%HBV DNA≥5.0log10,HBV DNA高水平者合并肝硬化的比例显著高于HBV DNA低水平者。无症状HBV感染、慢性乙型肝炎、代偿性和失代偿性肝硬化患者分别占4.1%、24.1%、39.0%和32.9%。71.0%的患者AFP升高,但其中仅33.8%AFP≥400ng/ml。结论:本组HBV相关HCC患者中,HBeAg阳性和高HBV DNA水平者不多,但病情常较重。肝硬化是HCC的重要危险因素,饮酒和肝癌家族史对HCC的发生有一定影响。血清AFP筛查有助于HCC的诊断。

静脉血放置时间对SysmexXE-2100血液分析仪白细胞分类结果的影响(英文)

目的探讨静脉血样品放置时间对SysmexXE-2100全自动血液分析仪白细胞分类结果的影响。方法室温下对SysmexXE-2100白细胞分类的精密度进行测定,然后对42例静脉血标本分别于0、2、4、8、24和48h用SysmexXE-2100进行测定,并将白细胞分类测定结果进行统计比较,再将SysmexXE-2100在0h的分类结果与手工分类结果进行比较。结果SysmexXE-2100白细胞分类的精密度在允许范围内,SysmexXE-2100白细胞分类结果与手工分类比较,中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞相关系数(r)分别为0.9859,0.9775,0.8053,0.8695,0.5243。大部分参数在8h内没有显著性改变,48hMONO(%),EOS(%)有极明显变化,BASO(%)改变明显,而MONO(%)在8h内已明显增高。结论室温下,静脉血标本白细胞分类计数应于8h内用SysmexXE-2100测定完成。

婴儿黄疸患儿尿中及母乳中人巨细胞病毒感染的研究

目的:了解婴儿黄疸患儿尿中人巨细胞病毒(HCMV)感染情况及HCMV通过母乳对婴儿的传播情况。方法:应用荧光定量PCR方法对858例患黄疸的婴儿尿及配对的316例母乳进行HCMV-DNA检测。结果:黄疸患儿尿中的HCMV-DNA阳性率为29.02%,母乳中的阳性率为59.18%;母乳HCMV-DNA阳性配对的患儿尿的HCMV-DNA阳性率为40.11%,母乳HCMV-DNA阴性配对患儿尿HCMV-DNA阳性率为18.60%,两组之间具有显著性差异(P<0.01)。结论:婴儿黄疸与HCMV感染有一定关系,HCMV感染母乳是婴儿获得性感染引起黄疸的主要途径之一。

巨细胞病毒IgG阳性育龄妇女体液阳性情况研究

目的:比较巨细胞病毒(CMV)IgG阳性育龄妇女外周血、尿液、阴道分泌物及乳汁中CMV排出情况,并探讨妊娠与体液排毒之间的关系。方法:应用酶联免疫吸附测定法对1 063例血清进行CMV IgG检测,阳性756例。对其中422例CMV IgG阳性的育龄妇女,应用实时荧光定量聚合酶链反应技术同时检测外周血白细胞、尿液、阴道分泌物中CMV DNA含量。22例孕妇随访至分娩,检测其乳汁中CMV排出情况。结果:422例CMV IgG阳性的育龄妇女中外周血白细胞、尿液、阴道分泌物CMV DNA检测的阳性率(1.4%、6.4%、13.7%)差异有统计学意义(χ2=48.615,P<0.01)。未妊娠妇女组、早期妊娠妇女组、中晚期妊娠妇女组分泌物CMV DNA阳性率(11.0%、14.4%、26.7%)差异有统计学意义(χ2=7.919,P=0.019)。随访的22例CMV IgG阳性孕妇有10例产后乳汁中检测出CMV DNA,阳性率为45.5%;孕期体液有CMV排出的孕妇分娩后乳汁中CMV的检出率高于孕期无体液排毒者。结论:对于CMVIgG阳性的育龄妇女,应重视无症状排毒情况,尤其重视对尿液、阴道分泌物以及产后母乳CMV排出的检测。

RNA干扰对乳腺癌细胞株MCF-7/Adr多药耐药性的逆转

目的研究小分子干扰RNA对乳腺癌耐药细胞株MCF7/Adr多药耐药性的逆转作用。方法设计针对mdrl基因的SiRNA,转染进MCF-7/Adr细胞;用荧光定量PCR检测mdrlmRNA的表达,流式细胞仪分析Pgp表达,MTT法检测阿霉素对MCF-7/Adr细胞的半数抑制浓度(IC50)。结果该SiRNA能使耐药细胞株MCF-7/Adr的mdrlmRNA和Pgp表达水平分别显著下调(P<0.01),并使阿霉素对MCF7/Adr的IC50显著降低(P<0.01)。结论RNA干扰可逆转乳腺癌MCF7/Adr细胞株的多药耐药性。

荧光定量PCR法检测中国籍海员血清HBV DNA

〔目的〕 了解远洋海员HBVDNA的实际感染情况 ,为国境口岸传染病监测策略提供基础数据。〔方法〕 选广州某口岸 2 0 0 3年 3月至 12月中国籍远洋海员体检血清标本 192例 ,用ELISA法检测 192份血清乙肝五项免疫学指标 ,以HBSAG阳性 12 1例为实验组 ,5 1例HBSAG阴性为对照组。用实时荧光定量PCR法同时检测HBVDNA病毒含量。比较两组HBVDNA检出差异。〔结果〕 192名远洋海员HBVDNA检出 78例 (40 % )。 5项血清免疫学指标和HBVDNA全部阴性 18例。实验组HBVDNA阳性 6 4例 (5 0 .0 2 % ) ,对照组HBVDNA阳性 14例 (2 7.4 5 % ) ,两组差异有显著意义 (χ2 <0 .0 1)。 14例HBSAG阴性HBVDNA阳性血清中 ,现行法规规定的三项传染性指标均为阴性 ,核心抗体均为阳性。〔结论〕 三项传染性指标阴性的人群仍有传播HBV的危险 ,建议有关部门修订远洋海员等特殊人群乙肝防治政策 ,直接检测HBVDNA。

IL-1β对人鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5AC mRNA的表达的影响

目的探讨IL-1β对鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5ACmRNA表达的影响。方法在培养的第二代人鼻黏膜上皮细胞加入IL-1β(10ng/ml)刺激24h后,采用荧光定量巢式RT-PCR检测人鼻黏膜上皮细胞中MUC5ACmRNA的定量表达。结果在培养的鼻黏膜上皮细胞上检测到MUC5ACmRNA的表达,IL-1β刺激组MUC5ACmRNA定量表达[(4.60±1.89)108拷贝/μg]均高于对照组[(2.50±1.40)107拷贝/μg],差异具有统计学意义(P<0.05﹚。结论 IL-1β诱导鼻黏膜上皮细胞中MUC5ACmRNA的表达增高,提示IL-1β可能具有上调鼻黏膜上皮细胞黏蛋白mRNA的表达的作用。