大鼠脂肪干细胞定向分化为成骨细胞及体外增殖过程中地塞米松的抑制性干预

背景:不同浓度的地塞米松在体外诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化过程中所起的作用是不同的,其作用机制尚不明确。目的:验证脂肪干细胞向成骨细胞分化的能力,观察成骨细胞分化早期不同浓度地塞米松对脂肪干细胞体外增殖的抑制效果。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/03在南方医科大学组织工程研究中心完成。材料:5周龄雄性SD大鼠10只,由南方医科大学实验动物中心提供。地塞米松为Sigma公司产品。方法:切取大鼠腹股沟皮下脂肪组织,用酶消化法分离培养脂肪干细胞,传至第3代后,加入条件培养液(含胎牛血清、维生素C、β-甘油磷酸钠、青霉素、链霉素的DMEM高糖完全培养基)进行体外预培养。设立2组:地塞米松组分别于细胞传代后第0,2,4天向培养基中加入10-6mol/L地塞米松1mL,空白对照组仅加入等量条件培养液。主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞生长及成骨分化情况。采用MTT比色法检测细胞增殖情况。结果:①原代培养中贴壁细胞多数呈长梭形,少数呈小圆形或三角形,六七天后进行传代;传代后细胞生长速度较原代细胞明显增快,至第15代细胞仍未出现明显衰老现象;第3代细胞在加入地塞米松后逐渐呈均一的长梭形,随时间延长呈叠形多层排列,细胞外基质明显增多,并逐渐形成多个小结样结构。空白对照组细胞形态不一,部分细胞呈多边形或三角形,细胞外基质明显少于地塞米松组,罕见小结样结构。②在体外传代培养过程中,空白对照组脂肪干细胞能够保持持续分裂增殖的能力。与空白对照组比较,细胞传代培养后0,2d加入地塞米松,干预6,8,10,12d时细胞数量均明显下降(P<0.05);传代培养后4d加入地塞米松,干预6,8,10,12d时细胞数量无明显变化(P>0.05)。结论:传代的脂肪干细胞经地塞米松处理后,细胞形态趋于成熟,生长速度减慢,可定向分化为成骨细胞。在向成骨细胞分化早期,地塞米松能够抑制脂肪干细胞的体外增殖。

荧光活性染料DiI标记的大鼠骨髓基质干细胞生长增殖及其成骨分化

背景:目前关于骨髓基质干细胞的标记报道较多,各有其优缺点,寻找一种有效、简便的细胞标记与示踪的方法尤为关键。目的:观察经荧光活性染料DiI标记的大鼠骨髓基质干细胞生长增殖与成骨分化情况。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-09/12在南方医科大学组织工程研究中心完成。材料:SD大鼠10只,由南方医科大学实验动物中心提供。DiI应用液为美国Molecular ProbeInc公司产品。方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞,加入无血清的DMEM制成细胞悬液,再加入1×109L-1的DiI应用液5μL,37℃下孵育25min,清洗离心后,加入DMEM高糖完全培养基,荧光显微镜观察细胞荧光强度及形态变化。另取传至第3代细胞,加入含地塞米松、维生素C、β-磷酸甘钠、体积分数为10%胎牛血清的成骨诱导剂进行诱导分化。主要观察指标:DiI标记后细胞形态变化,XTT比色法测定细胞增殖状况,细胞上清液中乳酸脱氢酶活性,成骨诱导后细胞碱性磷酸酶活性及成骨分化能力。结果:锥虫蓝染色见骨髓基质干细胞活力好,仅偶见蓝染细胞,荧光显微镜下DiI标记后全部细胞的胞浆、胞膜均显红色荧光,标记的骨髓基质干细胞呈梭形,胞浆丰富,保持了良好的正常形态,DiI标记阳性率为100%,标记早期细胞形态呈荧光环状,48h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光。与未标记细胞比较,DiI标记的骨髓基质干细胞增殖吸光度、培养上清液乳酸脱氢酶活性、碱性磷酸酶活性均无明显变化(P>0.05)。成骨诱导7d后,钙钴法染色两组骨髓基质干细胞均见不同程度的胞质呈棕黑色改变。结论:DiI能有效标记体外培养的骨髓基质干细胞,并在细胞内稳定表达,且标记细胞形态良好,对活体细胞无毒性作用;此外,DiI标记不影响骨髓基质干细胞的生长、增殖及成骨分化能力。

自体PRP促进人脂肪来源干细胞成骨分化的体外实验研究

目的探讨自体PRP对体外培养人脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)增殖及成骨分化的影响。方法取自愿捐献吸脂术获取的脂肪组织进行分离培养ADSCs,倒置显微镜下观察细胞生长情况。将第3代ADSCs分别行成脂、成软骨定向诱导培养鉴定,并行CD29及CD44免疫荧光染色观察。取第3代ADSCs分别采用含10mL/LPRP的成骨诱导培养基(PRP组)和不含PRP的成骨诱导培养基(对照组)进行培养,倒置显微镜观察细胞生长情况,培养后1、2、3、4、5d采用MTT法检测细胞增殖活性;7、14、21、28d行ALP活性检测,另取培养7、14d的PRP组细胞行ALP染色观察;14d时行PRP组茜素红染色检测钙结节形成情况。结果倒置显微镜下第3代ADSCs多为梭形,倍增时间约35h。成脂及成软骨诱导鉴定均为阳性,免疫荧光染色CD29和CD44呈阳性。MTT法示PRP组1、2、3、4、5d的吸光度值分别为0.137±0.015、0.219±0.023、0.367±0.031、0.586±0.039、0.948±0.046,对照组分别为0.081±0.009、0.115±0.012、0.162±0.017、0.242±0.025、0.356±0.032,两组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。成骨诱导7d后,PRP组ALP染色阳性,细胞胞浆呈灰黑色,可见黑色沉淀;14d后阳性细胞增多。ALP活性检测示PRP组7、14、21、28d细胞活性值分别为23.96±2.05、41.26±3.38、38.12±3.03、35.89±2.24,对照组分别为17.83±1.62、26.64±2.37、23.85±1.99、20.78±1.81,两组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。成骨诱导14d后,茜素红染色示PRP组钙结节形成。结论体外培养时,自体PRP可促进人ADSCs的增殖并诱导成骨分化,为骨组织工程提供一种新的种子细胞来源。