靶向性反向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3重组腺病毒诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的观察靶向性反向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（r—caspase-3）重组腺病毒体外诱导肝癌细胞凋亡的效果和特异性。方法构建甲胎蛋白（AFP）增强子和白蛋白（ALB）启动子腺病毒载体（pAdTrack．EATP．PALB），亚克隆r—caspase-3至载体pAdTrack—EAFP-PALB,PmeI线性化pAdTrack—EAFP．PALB／r—easpase．3，电转化至BJ／AdEasy菌，获得重组腺病毒骨架pAdeasy—EnrP-PALB／r．caspase一3。PacI酶切后脂质体转染AD293细胞进行包装、扩增、获得病毒。绿色荧光蛋白（GFP）监测病毒滴度和感染效率；RT-PCR和Western印迹法检测r-caspase．3在HepG2细胞中的表达；流式细胞术检测其特异性诱导肝癌细胞凋亡的作用。结果穿梭载体pAdTrack．EAFP-PALB／r—caspase-3酶切、测序正确。穿梭载体、pAdeasy-1载体同源重组后PCR及PacI酶切鉴定结果表明pAdeasy．E＆FP-PALB／r—caspase-3重组成功。转染AD293细胞后可观察到GFP的表达。病毒感染HepG2细胞总DNA经RT—PCR和Western印迹均可检测到目的基因的表达，证实Ad-E—FP-PAL／dr—caspase-3病毒颗粒包装成功；靶向性r—easpase-3重组腺病毒感染各组细胞24h后，各组凋亡指数分别为：HepG细胞48．2％、7721细胞17．7％、L-02细胞7．3％、MDA—MB-231细胞0％。结论成功构建了靶向性Ad．EAFP-PALB／r—caspase-3重组腺病毒，体外实验表明其具有凋亡诱导靶向性，为进一步研究靶向性r—caspase-3基因治疗肝细胞肝癌及其生物学功能提供了依据。