牛膝促进成骨细胞增殖的作用与机理研究

目的 :研究牛膝对成骨细胞株HFOB1 19的促增殖作用及其分子机制。方法 :制备牛膝含药血清 ,醇提法制备牛膝脱皮甾酮 ,MTT法检测二者对体外培养的HFOB1 19的促增殖作用 ,RT PCR检测PKARⅠ β的表达。结果 :牛膝含药血清与牛膝脱皮甾酮均能促进成骨细胞的增殖 ,并导致PKARⅠ β表达的上调。结果 :初步判定牛膝在体外有促进人成骨细胞增殖的作用 ,其主要作用成份为脱皮甾酮 ,并有可能是通过cAMP介导的信号传导途径进行的。

双龙接骨丸含药血清促进成骨细胞的增殖及其分子机制的研究

目的在体外研究骨伤药双龙接骨丸含药血清对成骨细胞增殖活动的影响,并对其分子机制进行初步探讨。方法制备双龙接骨丸含药血清,MTT 法观察体外含药血清对成骨细胞株 HFOB 1.19的促增殖作用,cDNA 微阵列技术分析含药血清导致的基因表达差异,寻找双龙接骨丸的可能作用途径。结果高、中、低剂量双龙接骨丸含药血清组较对照组均有明显促进 HFOB 1.19增殖的作用(P<0.01),此过程中至少有8种基因的表达量发生明显变化,其中 cAMP 依赖的磷酸激酶Ⅰ型调节亚基β(PKAP Ⅰβ)表达量上调1.8倍,GC 盒结合蛋白表达降低73%。结论初步判定双龙接骨丸含药血清在体外有促进人成骨细胞增殖的作用,并有可能是通过 cAMP 介导的信号传导途径进行的。

牛膝含药血清促进人T细胞增殖的作用与分子机制研究

目的 :研究牛膝对体外培养的人 T淋巴细胞增殖的影响及其可能的分子机制。方法 :制备牛膝含药血清 ,3 H-Td R掺入法检测其对体外培养的 T细胞的促增殖作用 ,RT-PCR检测 PKAR β的表达。结果 :牛膝含药血清能明显促进 T细胞的增殖 ,并导致 PKAR β表达的增加。结论 :初步认为牛膝在体外有促进人 T细胞增殖的作用 ,并有可能通过 c AMP介导的信号传导途径进行。

人PC-3细胞系中前列腺癌干细胞的富集与鉴定

【目的】从人前列腺癌PC-3细胞系中分离、富集并鉴定前列腺癌干细胞。【方法】采用无血清培养液(SFM)悬浮细胞聚球法体外培养PC-3细胞系,通过传代更新、诱导分化、交替在含血清/无血清培养液中培养等方法鉴定PC-3悬浮成球细胞具有强增殖性、自我更新和分化潜能等肿瘤干细胞特性。以PC-3悬浮成球细胞为实验组,常规在含血清培养液(SSM)中单层贴壁培养的PC-3细胞为对照组,采用流式细胞术检测两种细胞中CD44+CD133+细胞及侧群(SP)细胞比例。【结果】PC-3成球细胞可以在SFM中生存并形成悬浮细胞球,悬浮培养第5天时开始可以观察到典型的悬浮细胞球形成,第10天时细胞球形成效率约为(2.6±1.0)%,较第5天时明显增多(P<0.05)。PC-3悬浮成球细胞具有自我更新和分化能力,在体外可以连续、稳定传代,在SFM中滴加血清后可以分化,交替培养于SSM和SFM中可以实现与贴壁细胞之间的相互转化。PC-3悬浮成球细胞中CD44+CD133+细胞比率为13.94%,SP细胞含量为3.1%,均显著高于常规培养的PC-3贴壁细胞(分别为0.77%和0.0%,P<0.05)。【结论】PC-3悬浮成球细胞具有肿瘤干细胞特性,采用无血清悬浮细胞聚球培养法可以从PC-3细胞系中简便、高效地富集前列腺癌干细胞。

反义封闭PKARⅠβ基因表达对双龙接骨丸含药血清体外促成骨细胞增殖作用的影响

目的进一步明确cAMP依赖的磷酸激酶Ⅰ型调节亚基β(PKARⅠβ)在双龙接骨丸含药血清促进体外培养成骨细胞增殖过程中的作用。方法构建表达PKARⅠβ基因反义序列的重组子pcDNA-antiPKARⅠβ,脂质体法转导成骨细胞HFOB119,MTT法检测其增殖状况。结果高剂量含药血清处理的反义基因封闭组中,HFOB1.19的增殖能力与空白血清对照组无显著差异(P>005)。结论双龙接骨丸含药血清的体外促成骨细胞增殖作用与PKARⅠβ基因的表达密切相关。

翻译起始区二级结构对荧光素酶基因在COS-7细胞中表达效率的影响

在荧光素酶基因起始密码子ATG下游插入4种串连重复的密码子(6×ATT ,3×ATT ,6×GCC与3×GCC) ,得到具有不同二级结构的翻译起始区(translationinitiationregion ,TIR) ,以研究TIR二级结构对该基因在COS 7细胞中表达的影响.Northern印迹结果显示,4种重组子mRNA的转录水平没有显著差异,而Western印迹与酶活性检测表明,与野生型结构相比,6×ATT与3×ATT能显著提高荧光素酶的表达量与活性,而6×GCC结构的表达量明显下降.使用计算机辅助分析软件,扫描上述TIR结构发现,TIR稳定性或二级结构复杂度是导致上述表达差异的主要原因.

C3H10T 1/2小鼠胚胎成纤维细胞Dlxin 1基因表达及骨形态发生蛋白2的调控机制

背景:Dlxin1可与成骨相关转录因子Dlx、Msx家族成员相互作用调节其转录活性,骨形态发生蛋白2可诱导小鼠胚胎成纤维细胞(C3H10T1/2)向成骨细胞分化。目的:对C3H10T1/2小鼠胚胎成纤维细胞中Dlxin1基因的表达及骨形态发生蛋白2调控机制进行初探。设计、时间及地点:细胞分子水平实验,于2007-03/10在暨南大学生物工程研究所实验室完成。材料:C3H10T1/2细胞为ATCC产品,骨形态发生蛋白2为自产,DH5α为自备。方法:用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测骨形态发生蛋白2对基因表达的影响,用双荧光报告载体系统搜寻Dlxin1的上游启动子元件,用凝胶迁移实验(EMSA)对其精确定位。主要观察指标:①细胞中Dlxin1基因mRNA的表达情况。②pGL3-Dlxin1系列缺失突变报告载体荧光活性及启动子片段与C3H10T1/2细胞核蛋白的结合能力检测。结果:在转录水平上骨形态发生蛋白2可以诱导Dlxin1基因表达上调;Dlxin1启动子基础活性和骨形态发生蛋白2诱导活性调控区域均位于转录起始位点上游-943～-728bp之间;EMSA证实,-758～-748bp这一片段是调控核心区域。结论:转录因子通过与Dlxin1启动子上游TATAbox结合来调控Dlxin1基因的转录。