雷帕霉素对血管平滑肌细胞增殖影响的实验研究

目的观察雷帕霉素(rapamycin)对体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞(SMC)增殖的作用。方法组织贴块法体外原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,取对数生长期细胞(第6￣10代)用作实验,MTT法检测不同浓度雷帕霉素对平滑肌细胞增殖的效果,并用RT-PCR法检测其对平滑肌细胞增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)mRNA表达情况的影响。结果①MTT法检测显示雷帕霉素呈剂量依赖性抑制体外培养的大鼠平滑肌细胞增殖,各组吸光值(A)分别为:对照组0.902±0.106;0.1ng/mL组0.873±0.079;1ng/mL组0.797±0.046;10ng/mL组0.692±0.061;100ng/mL组0.624±0.075。方差分析差异有显著性,F=28.85,P<0.001;两两比较1ng/mL以上浓度组与对照组间差异均有显著性,不同浓度间差异显著。0.1ng/mL组与对照组相比差异无显著性。②RT-PCR显示雷帕霉素以浓度依赖模式抑制大鼠平滑肌细胞PCNA-mRNA合成。各组校正后光密度值分别为:对照组219.35±7.20;0.1ng/mL组212.39±6.56;1ng/mL组113.15±10.09;10ng/mL组97.17±12.25;100ng/mL组84.38±8.66。方差分析F=195.49,P<0.001。两两比较与MTT检测相同。结论雷帕霉素呈剂量依赖性显著抑制大鼠平滑肌细胞的增殖,1ng/mL时即可明显起效。雷帕霉素有望成为治疗内支架术后再狭窄的理想药物之一。

人增生性瘢痕成纤维细胞最佳转染条件:α_1(I)型前胶原基因反义寡核苷酸转染的实验

目的:选择α1(I)型前胶原基因反义寡核苷酸转染人增生性瘢痕成纤维细胞的最佳条件。方法:实验于2003-10/2004-06在中山大学附属第一医院外科实验室进行。以阳离子脂质体Oligofectamine转染体外培养的第2～6代人增生性瘢痕成纤维细胞,应用荧光显微镜记录荧光素在细胞内的空间分布,用流式细胞术作荧光细胞计数和观察细胞凋亡,通过不同细胞接种数量、反义寡核苷酸浓度和脂质体量转染条件的比较,逐步获得各转染过程中的最佳条件。结果:①在6孔板上转染反义寡核苷酸,所用各转染条件未引起细胞凋亡。②其最佳转染条件为:接种细胞数量32.25×104/皿,反义核酸浓度150nmol/L,脂质体量3μL/孔;转染后细胞浆和细胞核内均有荧光素聚集。结论:获得α1(I)型前胶原基因反义寡核苷酸转染的人增生性瘢痕成纤维细胞的最佳转染条件,可为下一步试验提供基础。

器官移植受者巨细胞病毒感染检测的临床意义

目的探讨器官移植受者巨细胞病毒感染早期、快速、准确的检测方法。方法采用核酸基础序列扩增法(nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA法)检测器官移植受者巨细胞病毒即刻早期信使核糖核酸(immediate-early,IE-mRNA)以及晚期信使核糖核酸(pp67-mRNA),同时行抗原血症(pp65)的检测,并将结果相比较。结果42例器官移植受者中发生有症状的活动性巨细胞病毒感染者(CMV病)共11例,其中IE-mRNA阳性10例,pp67-mRNA阳性6例,pp65抗原阳性(≥1个/5万WBC)8例。IE-mRNA的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为90.9%、80.6%、62.5%和96.1%。结论器官移植术后应用NASBA法检测巨细胞病毒IE-mRNA具有早期、快速、特异的优点,为临床指导抗病毒治疗提供了较客观的依据。

Annexin A1在胃癌中的表达及其与胃癌预后的关系

【目的】通过检测Annexin A1蛋白在胃癌原发灶和转移灶中表达,探讨Annexin A1表达的病理临床意义及对预后的影响。【方法】构建组织芯片包含胃癌原发灶及相应的转移灶70对、癌旁组织30例,应用免疫组化方法检测Annexin A1在胃癌组织芯片中的表达,结合病理临床资料及生存资料,分析Annexin A1表达与病理临床参数的相关性。【结果】Annexin A1在癌旁组织中不表达,在胃癌原发灶中的阳性表达率为4/70(5.7%),淋巴结转移灶中的表达率为17/70(24.3%),差异有统计学意义(P<0.05)。淋巴结转移灶ANXA1的表达与TNM高分期相关(P<0.05)。Kaplan-Meier分析显示淋巴结转移灶ANXA1表达阳性组患者生存时间较阴性组短,差异有统计学意义(P<0.05)。logistic回归多因素分析ANXA1表达阳性是胃癌早期死亡的危险因素。【结论】Annexin A1的表达与肿瘤的远处转移、胃癌患者的早期死亡密切相关。

肿瘤型M2丙酮酸激酶与癌类抗原19-9联合检测在胰腺癌诊断中的应用

目的:探讨肿瘤型M2丙酮酸激酶(TumorM2-PK,TuM2-PK)、糖类抗原19-9(CA19-9)在胰腺癌中的表达特性。方法:采用ELISA法分别检测50例胰腺癌患者、35例胰腺炎患者及80名健康体检人血中TuM2-PK、CA19-9含量。结果:胰腺癌患者血中TuM2-PK、CA19-9值分别是(164.9±41.3)U/mL、(630.1±200.3)U/mL。在胰腺癌的诊断中单独检测时TuM2-PK、CA19-9敏感性分别为75%、74.5%,特异性分别为90%、85%,联合测定敏感性、特异性分别达到82.3%、100%。结论:联合检测TuM2-PK、CA19-9有助于提高对胰腺癌诊断的特异性和敏感性。

猪-人-鼠嵌合体动物模型的建立及介导人T细胞对猪异种抗原的耐受

目的:通过共移植人胎胸腺、胎肝组织及猪骨髓细胞于SCID鼠体内,建立猪-人-鼠嵌合体模型,介导人T细胞对猪异种抗原的免疫耐受。方法:实验鼠分成3组:A组为猪骨髓细胞移植组,B组为人胎胸腺、肝脏组织移植组,C组为猪骨髓细胞+人胎胸腺+肝脏组织移植组;在移植后每3周,用流式细胞仪测定猪和人嵌合体的水平,直至20周;通过混和淋巴细胞反应确定人T细胞的功能及对猪异种抗原的耐受情况。结果:猪嵌合体在所有实验鼠(包括共移植人组织的实验鼠)中持续时间均超过20周;在移植人胎组织20周时,T细胞的数量为0.7×106/L,在外周血细胞中所占的百分比为0.14%±0.01%;人嵌合体在所有实验鼠(包括共移植猪骨髓细胞的实验鼠)中持续时间亦超过20周。结论:通过共移植人胎胸腺、胎肝组织及猪造血干细胞于SCID鼠体内,可以建立猪-人-鼠嵌合体模型,并能诱导人T细胞对猪异种抗原的免疫耐受。

国产氢溴酸西酞普兰片的药物代谢动力学特征及相对生物利用度

目的:观察国产选择性5-羟色胺再摄取抑制剂氢溴酸西酞普兰片在正常人体内的药物代谢动力学行为,并与进口氢溴酸西酞普兰片进行生物等效性的对比。方法:选择经医院伦理委员会审议通过的健康男性志愿受试者20人。实验前签署知情同意书,受试期间停服任何药物,并禁烟和酒。采用随机交叉设计,口服国产氢溴酸西酞普兰片和进口氢溴酸西酞普兰片剂40mg,(国产氢溴酸西酞普兰片由北京万全药物技术开发有限公司和徐州恩华药业集团有限责任公司共同研发,20mg/片;进口氢溴酸西酞普兰片,商品名希普妙,丹麦灵北药厂,20mg/片)。服药后0.5～132h内间隔取血。血样加入内标盐酸普萘洛尔经预处理后用高效液相色谱测定。计算主要药物代谢动力学参数,并以进口片剂为参比制剂,估算国产氢溴酸西酞普兰片的生物利用度,判断其生物等效性。结果:志愿者1人缺席,1人在第一轮试验服药后1h发生呕吐,且132h的血药浓度为7.1μg/L,0.5h血药浓度为0,吸收和代谢均有影响,故舍去;其余18人进入结果分析。国产氢溴酸西酞普兰片和进口氢溴酸西酞普兰片的血药浓度-时间曲线均符合二房室模型,其血药浓度-时间曲线下面积AUC0-132分别为(1894.6±460.2)μg/(h·L)和(1876.9±398.3)μg/(h·L),差异无显著性(P>0.05);达峰浓度分别为(46.1±9.8)μg/L和(47.7±11.7)μg/L,差异无显著性(P>0.05);半衰期分别为(37.6±10.0)h和(38.8±9.8)h,差异无显著性(P>0.05);达峰时间分别(3.2±1.9)h和(3.2±1.5)h,差异无显著性(P>0.05)。以进口制剂为对照,用血药浓度-时间曲线下面积AUC0-132计算的国产氢溴酸西酞普兰片生物利用度为(100.3±11.7)%。结论:国产氢溴酸西酞普兰片与进口氢溴酸西酞普兰片具有生物等效性。

血管内皮生长因子C及膜突蛋白表达与宫颈癌恶性进展的相关性

【目的】研究宫颈癌恶变过程中血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C)及膜突蛋白(moesin)的表达变化,并在培养的宫颈癌细胞中初步探讨VEGF-C对膜突蛋白的调控作用。【方法】利用临床上活体取材的不同临床分期的宫颈癌组织标本及正常对照宫颈组织,蛋白免疫印迹法检测VEGF-C及moesin蛋白的表达情况。体外培养宫颈癌细胞株Hela细胞,蛋白免疫印迹法测定VEGF-C对moesin蛋白的表达和磷酸化的调控作用。【结果】随着宫颈癌临床分期的增高,VEGF-C、moesin蛋白及磷酸化moesin蛋白表达水平均随之增加。与正常宫颈组织比较,宫颈原位癌(CIN)组织中VEGF-C、moesin、磷酸化moesin蛋白表达分别增加了45%±9%、63%±12%、74%±16%(P<0.05);宫颈鳞癌Ⅰ期各蛋白增高幅度分别为94%±18%、104%±27%、123%±30%(P<0.01);宫颈鳞癌Ⅱ期(未放疗化疗)各蛋白表达增高更为显著,其幅度分别为186%±24%、246%±37%、194%±28%(P<0.001)。在培养的宫颈癌细胞株HeLa细胞上,VEGF-C(100#g/L)处理24h后,可显著增高moesin蛋白、磷酸化moesin蛋白的表达。VEGF-C单克隆抗体可抑制VEGF-C对moesin蛋白表达及磷酸化的上调作用。【结论】VEGF-C、moesin蛋白表达与宫颈癌恶性程度密切相关,推测VEGF-C可能通过上调moesin表达及其磷酸化水平而促进宫颈癌的恶性进展。

ITP患者脾切除前后外周血Th亚群细胞因子的变化及意义

目的:探讨辅助性T淋巴细胞(T helper lymphocyte,Th)亚群细胞因子在原发性免疫性血小板减少症(ITP)患者脾切除术前后的表达及意义。方法:采用QuantiGene Plex(QGP)方法检测22例ITP患者腹腔镜脾切除术前后外周血Th1(IL-2和IFN-γ)、Th2(IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)、Th3(TGF-β1)和Th17(IL-17)细胞因子mRNA表达水平的变化。30例健康体检者作为对照组。结果:(1)术前组IL-2表达水平较对照组明显降低(P<0.05),IL-17表达水平较对照组明显升高(P<0.05),其它细胞因子表达水平在术前组和对照组之间无显著差异(P>0.05)。术后组TGF-β1表达较术前组和正常对照组均明显升高(P<0.05);术后组IL-2表达较术前有所升高(P<0.05),但仍低于对照组(P<0.05)。其它细胞因子表达水平在术前组和术后组之间无显著性差异(P>0.05)。(2)术前IL-2与IFN-γ之间成正相关(r=0.647,P<0.01),术前其它细胞因子之间均无明显相关性(P>0.05)。术后3对细胞因子之间成正相关,分别是IL-2与IFN-γ(r=0.787,P<0.01),IL-17与IL-2(r=0.554,P<0.01),IL-17与IFN-γ(r=0.461,P<0.05);术后其它细胞因子之间均无明显相关性(P>0.05)。结论:ITP患者存在Th亚群细胞因子失衡,脾切除术可改善ITP患者部分Th亚群细胞因子的失衡。

糖尿病患者血清超敏C反应蛋白、白细胞介素-6及白细胞介素-10的变化

目的:研究血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-10(IL-10)在糖尿病患者中的变化,及其对心血管并发症的预示作用。方法:收集99例糖尿病患者血清,其中胆固醇正常者68例,胆固醇升高者31例,及50例正常体检人员的血清。使用乳胶增强免疫透射比浊法检测hs-CRP,一步酶法检测胆固醇,同时采用ELISA双抗体夹心法测定血清IL-6、IL-10。结果:正常对照组血清hs-CRP、IL-6和IL-10浓度分别为(1.66±0.95)mg/L、(24±8)ng/L和(27±7)ng/L,胆固醇正常糖尿病组血清hs-CRP、IL-6和IL-10浓度分别为(2.77±1.19)mg/L、(25±10)ng/L和(28±8)ng/L,胆固醇升高糖尿病组血清hs-CRP、IL-6和IL-10浓度分别为(5.70±1.81)mg/L、(34±10)ng/L和(21±5)ng/L。与正常对照组、胆固醇正常糖尿病组相比,胆固醇升高糖尿病组hs-CRP、IL-6和IL-10表达水平差异均有统计学意义(分别为P<0.01、P<0.05、P<0.05)。与正常对照组比较,胆固醇正常糖尿病组hs-CRP高表达(P<0.05),而这两组间IL-6和IL-10表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:炎症因子hs-CRP在预测糖尿病患者并发冠心病中具有重要的临床意义。

抗原致敏IL-12基因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究

【目的】探讨肾癌细胞抗原致敏白介素-12(IL-12)基因修饰的树突状细胞(DC)体外诱导、激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫杀伤肾癌细胞的效能及相关免疫机制。【方法】采用重组逆转录病毒介导IL-12基因修饰人外周血单个核细胞(PBMC)来源的DC;超声细胞破碎法提取肾癌细胞粗提抗原(Ag)致敏经IL-12转染的DC;ELISA法检测各组DCs和各组CTLs上清中IL-12、IFN-γ因子的分泌水平;流式细胞仪(FACS)分析各组DCs表面CD83、CD86、HLA-DR的表达;MTT法检测DC刺激同源T淋巴细胞增殖的能力及CTL免疫杀伤肾癌细胞的效能;统计学分析比较各组间的差异。【结果】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC高表达CD83和CD86分子分别为(65.9%±3.1%,92.8%±3.4%),分泌高水平IL-12(279.6±1.7)pg/mL及IFN-γ(892±31)pg/mL,刺激同源T淋巴细胞增殖明显,诱导激活的CTL上清中IFN-γ水平(1146±31)pg/mL显著高于对照组;CTL对肾癌细胞有强大的杀伤作用,显著高于各对照组。【结论】经IL-12基因修饰和抗原致敏后的DC能有效地诱导CTL特异性抗肿瘤免疫应答。其机制可能与IL-12基因修饰和抗原致敏活化了DC抗原提呈第二信号,促进了DC高分泌IL-12因子,激活了T淋巴细胞致使CTL分泌IFN-γ的能力增强密切相关。

烟碱拮抗秋水仙碱诱导大鼠大脑皮质神经元凋亡的作用

【目的】研究烟碱对皮质神经元的保护作用。【方法】在培养至第6天的皮质神经元中以不同浓度(1 μmol/L,10μmol/L,100μmol/L)烟碱预孵2 h,再加入0.1μmol/L秋水仙碱作用24 h。通过相差显微镜形态学观察,Hoechst33258核荧光染色进行凋亡率计数和测定乳酸脱氢酶相对释放量(LDH)的实验,再测试10μmol/L 预孵不同时间(0.5,2,8)h的烟碱对秋水仙碱诱导大鼠大脑皮质神经元凋亡的作用。【结果】秋水仙碱可诱导皮质神经元调亡,烟碱可拮抗秋水仙碱的此种作用。其中10μmol/L烟碱预孵2 h保护作用最强。【结论】烟碱可拮抗秋水仙碱诱导大鼠大脑皮质神经元凋亡的作用。

白三烯受体拮抗剂抑制小鼠急性哮喘呼吸道炎症的研究

目的应用白三烯受体1拮抗剂孟鲁斯特(montelukast,MK)治疗小鼠急性哮喘呼吸道炎症,探讨MK对白细胞介素-5(IL-5)和嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)表达及血清总IgE水平的影响。方法卵清蛋白(OVA)致敏并激发Balb/c小鼠建立急性哮喘模型。静脉予MK(25 mg/kg)或Saline 3 d。瑞氏染色观察小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)炎症细胞,酶联免疫吸附法(ELISA)检测肺组织、BALF和血清IL-5和eotaxin及血清总IgE水平。半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测IL-5和eotaxin的mRNA表达。液相色谱方法检测血MK水平。结果OVA激发后24 h,MK组BALF白细胞总数、嗜中性和嗜酸性粒细胞(EOS)分别为(26.0±18.9)×107/L(、5.92±8.09)×107/L和(0.74±0.88)×107/L,较Saline组相应数明显减少(P均<0.05)。EOS减少达80%以上。MK组BALF和肺组织IL-5分别为(48.52±14.45)ng/L和(27.40±9.62)ng/g蛋白,较Saline组相应值明显降低(P均<0.05);MK组血清IL-5和总IgE水平明显减低。MK组BALF中eotaxin水平也明显降低(P<0.05);MK组肺组织IL-5 mRNA显著降低,肺eotaxin及其mRNA水平无明显下降。结论MK可能通过抑制IL-5和IgE产生和分泌起抗炎作用。

HLA-B27基因检测对诊断强直性脊柱炎的临床意义

目的 :探讨进行HLA B2 7基因检测对早期诊断强直性脊柱炎 (AS)的临床意义。方法 :采用聚合酶链反应 序列特异性引物技术 (PCR SSP)方法对 6 80例患者 (其中AS患者 15 0例 ,5 30例其它疾病患者 )进行HLA B2 7基因检测。结果 :6 80例标本中 ,15 0例AS患者 138例 ( 92 0 % )HLA B2 7抗原阳性 ,其他 5 30例患者 5 1例 ( 9 6 2 % )HLA B2 7抗原阳性 ,检测结果的敏感性为 92 0 % ,特异性为 89 6 %。结论 :HLA B2 7基因与AS呈高度相关性 ,可以作为AS的早期辅助诊断和鉴别诊断的指标。

半乳糖凝集素3在血管内皮生长因子C促宫颈癌转移中的作用

【目的】研究半乳糖凝集素3(Gal-3)在血管内皮生长因子C(VEGF-C)促宫颈癌转移中的作用。【方法】体外培养宫颈癌细胞株SiHa细胞,免疫印迹法检测不同浓度的Gal-3作用于细胞不同时间,对VEGF-C受体(VEGFR3)磷酸化的影响;以VEGF-C处理SiHa细胞10 min,免疫共沉淀法观察Gal-3与VEGFR3的蛋白交联变化;转染Gal-3 siRNA抑制Gal-3表达后,采用Transwell侵袭小室法观察VEGF-C对SiHa细胞侵袭的影响。【结果】Gal-3(10μg/mL)处理SiHa细胞2 min、5 min及10 min后,均能促进VEGFR3磷酸化,其增加幅度分别为(162.4±10.4)%(n=3,P<0.05)、(202.5±16.2)%(n=3,P<0.01)、(282.4±18.6)%(n=3,P<0.001)。不同浓度的Gal-3(2、5、10μg/mL)处理SiHa细胞10 min,均能促进VEGFR3磷酸化,其增加幅度分别为(144.6±6.5)%(n=3,P<0.05)、(192.8±12.4)%(n=3,P<0.01)、(263.6±15.4)%(n=3,P<0.001)。VEGF-C(100 ng/mL)处理SiHa细胞10 min后,与对照组比较,VEGFR3与Gal-3之间的蛋白交联明显增加。VEGF-C可明显促进SiHa细胞的侵袭,与对照组比较,其增加幅度为(263.6±32.8)%(n=5,P<0.01)。而在转染特异性Gal-3 siRNA 48 h抑制Gal-3表达后,VEGF-C促细胞侵袭的能力明显减弱,抑制率为(80.5±10.2)%(n=5,P<0.01)。【结论】Gal-3可介导VEGF-C促宫颈癌细胞侵袭的作用,这一效应可能与Gal-3交联VEGFR3蛋白,并进一步引发VEGFR3磷酸化有关。

肾移植受者巨细胞病毒RNA检测及其临床意义

目的建立一种早期快速准确的诊断移植术后人巨细胞病毒感染的新方法。方法采用核酸基础序列扩增法(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)检测肾移植术后患者外周血标本的巨细胞病毒即刻早期(immediate-early,IE)mRNA及晚期结构抗原pp67的mRNA,同时行抗原血症(pp65)检测,并将结果相比较。结果在接受肾移植的55例患者中,IE-mRNA阳性20例;有症状的活动性巨细胞病毒感染13例。IE-mRNA的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为92.3%,83.3%,60.0%和97.1%。结论移植术后IE-mRNA序列扩增法检测能够早期、快速、客观的反映人巨细胞病毒活动性感染的状况,对临床抗病毒药物治疗具有指导意义。

Sonic Hedgehog信号通路对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响

目的研究Sonic Hedgehog信号通路在宫颈癌细胞生长、迁移和侵袭中的作用。方法采用噻唑蓝比色法检测不同浓度重组Shh-N和Shh中和抗体对宫颈癌Hela细胞生长的影响,采用Transwell迁移和侵袭实验观察不同浓度重组Shh-N和Shh中和抗体对宫颈癌Hela细胞迁移和侵袭能力的影响。结果重组Shh-N呈剂量依赖性促进Hela细胞生长、迁移和侵袭;Shh中和抗体呈剂量依赖性抑制Hela细胞生长、迁移和侵袭。结论 Sonic Hedgehog信号在宫颈癌细胞生长、迁移和侵袭中发挥重要作用。

核基蛋白监测膀胱癌复发的临床价值

【目的】探讨核基蛋白(NMP22)在监测复发性膀胱移行细胞癌的临床价值。【方法】应用酶联免疫法检测81例膀胱癌术后患者的尿 NMP22含量,并与膀胱镜检查和尿细胞学检查(UC)相比较。【结果】膀胱镜检有44例证实复发,其中有33例尿 NMP22表现为阳性,敏感性为75.0%,特异性为94.6%,10例 UC 检查表现阳性,敏感性为22.7%。在病理分期 T_a、T_1>T_2组中敏感性分别为60.0%、72.7%、85.7%,T_a 与 T_1,T_a 与 T_2组差异显著,P<0.05,分级 G_1、G_2、G_3组中敏感性为71.4%、72.2%、91.7%,G_1与 G_2,G_1与 G_3组差异显著,P<0.01。【结论】尿 NMP22不但可以监测膀胱癌的复发,还可以大致判断膀胱癌的浸润性和恶性度。