多重置换扩增结合短串联重复序列在植入前遗传学诊断中的应用

目的：探讨多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）结合短串联重复序列多态性在植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）中的应用。方法：采用多重置换扩增对单细胞进行全基因组扩增，针对单基因疾病和人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）配型选择位于致病基因内部或两侧的短串联重复序列位点进行单体型分析，同时对致病基因进行直接检测；针对染色体数量及结构异常或非整倍体筛查，选择位于相关染色体上的短串联重复序列位点进行等位基因数分析。结果：进行了以下5类12种类型植入前遗传学诊断的临床应用：（1）单基因疾病：脊髓性肌萎缩症、杜氏肌营养不良、X-连锁慢性肉芽肿、石骨症、骨软骨发育不全、Ｘ-连锁免疫缺陷综合征；（2）同时合并两种单基因疾病：α-和β-双重地中海贫血；（3）染色体罗氏易位；（4）单基因疾病结合HLA配型：β-地中海贫血、杜氏肌营养不良；（5）单基因疾病合并染色体异常：α-地中海贫血合并染色体罗氏易位、α-地中海贫血合并性染色体数目异常。对35个家系共进行了44个周期的PGD，共47个移植周期。MDA扩增成功率为96.4%（374/388），后续PCR扩增效率为97.1%，等位基因脱扣（allele drop out，ADO）率为12.6%（波动于0~47.5%），总体诊断效率为94.6%（367/388）。47个移植周期共移植91个胚胎，种植率为30.7%（28/91）。临床妊娠率为47.7%/PGD周期（21/44），共诞生了20个健康婴儿（12例单胎，4例双胎），5例继续妊娠。结论：采用多重置换扩增结合短串联重复序列多态性可建立一个通用的植入前遗传学诊断平台，其很大程度上缩短了新病种植入前遗传学诊断体系的研发时间，而且可同时进行两种或两种以上遗传学状态的诊断，也提高了诊断效率，有利于进一步拓宽植入前遗传学诊断的适应征。

短时受精后提早剥离颗粒细胞对体外受精的影响

【目的】研究在人体外受精过程中提早剥除颗粒细胞对受精和发育的影响。【方法】对本中心行短时受精（5 h）的53对夫妇纳入研究,当其精卵孵育5 h之后,将所用卵子平均分为2组（5 h组和19 h组）,分别于受精5 h和19 h时剥除颗粒细胞。观察两组中同一批卵子受精情况并用荧光原位杂交（FISH）技术分析多原核胚胎中原核（PN）来源。【结果】5 h组和19 h组两组之间的正常受精率（两原核率）、单原核率和未成熟卵率相似,差异均无统计学意义,然而多原核率在5 h组明显高于19 h组﹝（10.9±12.4）%vs.（4.5±7.6）%,P=0.001﹞。同时在5 h组中正常受精卵子原核的直径在受精后19 h时明显大于19 h组的正常受精卵子原核的直径[（24.27±2.20）μm vs.（20.90±3.14）μm,P=0.0001﹞。培养至第3天时两组的可利用胚胎率和优质胚胎率相似,差异无统计学意义。FISH的结果显示,两组多原核胚胎中原核的Y染色体/X染色体的比例为0.533~0.547,理论上更接近于多精受精。【结论】提早剥除颗粒细胞不影响人胚胎的体外发育,但是可能会影响原核的发育并导致体外受精过程中多精受精比例的增加。

诱发排卵前意外排卵

诱发排卵前意外排卵多伴随着早发LH峰的出现及孕酮(P)升高,导致内膜种植窗提前关闭,影响胚胎着床。降调节周期早发LH峰的原因包括降调节到取卵时间过长、降调节剂量不足、诱发排卵到取卵时间过长、取卵前同房刺激排卵及可疑垂体调节机制异常。临床可根据血清LH、E2和P的水平给予不同处理,以最大限度地降低早发LH峰对助孕结局的不良影响。

在β地中海贫血着床前遗传学诊断中应用多重置换扩增进行预处理的临床分析

目的分析应用多重置换扩增技术(multiple displacement amplification,MDA)进行全基因组扩增的预处理是否影响β地中海贫血着床前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)的准确效能。方法回顾性地分析2009年1月至2013年6月,因双方均为β地中海贫血携带者而行PGD治疗的周期资料,其中34个周期采用多重巢式聚合酶链反应(PCR)结合反向斑点杂交技术对单细胞进行诊断,另有38个周期行MDA进行全基因组扩增的预处理后,再结合反向斑点杂交技术进行诊断。结果两组患者在年龄、获卵数等实验室指标上无统计学差异。MDA组未检出(扩增失败)率为9.79%,低于行巢式PCR组的15.24%,而杂合子率46.33%则略高,但两种方法在诊断结果上并无统计学差异。结论应用MDA技术进行全基因组的预扩增可有效增加检测模板,实现多位点及多种疾病的诊断,而且不影响β地中海贫血地贫基因的诊断效能。

应用全基因组扩增技术对α地中海贫血进行植入前遗传学诊断的效果分析

目的研究α地中海贫血患者囊胚活检后先进行全基因组扩增后再应用荧光PCR进行诊断的效果。方法回顾分析本中心2015年1月至2016年11月α地中海贫血PGD周期资料,共139个周期,对比分析卵裂球活检后直接应用荧光PCR进行诊断(诊断方法一)与囊胚活检后先进行全基因组扩增后再应用荧光PCR进行诊断(诊断方法二)的结果。结果两组在女方年龄、获卵数、正常受精数均无统计学差异(P>0.05),但方法二(7.61±3.05)的平均活检个数显著小于方法一(9.48±3.66)(P<0.05)。两种方法的正常胚胎率(35.22%vs.25.87%)、杂合子胚胎率(30.11%vs.50.19%)、异常胚胎率(30.11%vs.23.94%)、诊断失败率(16.21%vs.2.81%)有统计学差异(P<0.05),临床妊娠率(50.00%vs.52.17%)无统计学差异(P>0.05)。结论囊胚活检后先进行全基因组扩增后再应用荧光PCR进行诊断的效果明显好于卵裂球活检后直接应用荧光PCR进行诊断。

传统的荧光原位杂交与单核苷酸多态性微阵列技术在植入前遗传学诊断中的比较

【目的】对染色体易位携带者的植入前遗传学诊断(PGD),随机的采用传统荧光原位杂交技术结合卵裂球活检并新鲜周期移植的策略,或单核苷酸多态性微阵列技术结合滋养外胚层活检并冷冻周期移植的策略,对两种策略的诊断结果及妊娠结局进行比较,以选择最佳的诊断策略。【方法】回顾性的分析了2012年4月至2014年6月,染色体易位携带者行PGD的183个周期资料,其中91个FISH-PGD周期采用D3卵裂球活检并新鲜周期移植的策略,记为FISH组、92个SNPPGD周期采用滋养外胚层活检并冷冻周期移植的策略,记为SNP组。将两组方法的诊断结果及妊娠结局进行比较。【结果】SNP组的无胚胎移植周期低于FISH组,差异有统计学意义;诊断正常率SNP组为33.8%,高于FISH组,两者间差异有统计学意义;移植周期临床妊娠率方面,SNP组高于FISH组而早期流产/胎停率则低于FISH组。【结论】SNP-PGD的滋养外胚层活检结合冷冻周期移植的策略有助于获得更好的临床妊娠结局。

非强效卵巢刺激的地中海贫血患者胚胎种植前遗传学诊断助孕治疗结局

【目的】观察非强效卵巢刺激的地中海盆血(地贫)患者胚胎种植前遗传学诊断助孕治疗结局,探讨特殊助孕目的下地贫患者卵巢反应性及合适的刺激强度。【方法】收集70名因地中海贫血行胚胎种植前遗传学诊断治疗(实验组)及57名因男方因素行单精子卵胞浆内注射患者(对照组),比较其在同等强度刺激下的卵巢反应及临床结局。【结果】在基础内分泌水平及卵巢刺激强度可比情况下,实验组可移植胚胎数显著少于对照组,差异具有统计学意义(P=0.021);两组患者的获卵数、临床妊娠率、每移植周期活产率均没有统计学差异。【结论】地贫状态不影响患者卵巢反应性,在非强效卵巢刺激下,行胚胎种植前遗传学诊断助孕治疗的地贫患者也可获得满意的临床结局。

超排卵全程应用225U促黄体生成素对取卵及胚胎移植日血清血管内皮生长因子水平的影响

【目的】探讨促黄体生成素在控制性超排卵中降低血清血管内皮生长因子水平的有效性。【方法】20例在超排卵全程添加225 U促黄体生成素(实验组)同50例未添加患者(对照组)比较超排卵启动日血清血管内皮生长因子水平,人绒毛膜激素注射日、取卵日及胚胎移植日血清血管内皮生长因子较启动日的升高水平。【结果】试验组及对照组启动日血清血管内皮生长因子水平及人绒毛膜激素注射日血清血管内皮生长因子较启动日的升高水平差异不具有统计学意义;试验组取卵日(P=0.017)及胚胎移植日血清血管内皮生长因子较启动日的升高水平(P=0.009)同对照组相比,差异具有统计学意义。【结论】225 U促黄体生成素在超排卵全程应用可有效降低取卵及胚胎移植日血清血管内皮生长因子水平。

睾丸尖钳穿刺取精手术并发症原因分析及护理

目的探讨睾丸尖钳穿刺取精手术并发症发生原因,并总结护理要点,以便为患者提供有效的护理方法。方法 2013年6月至2018年3月在本院生殖医学中心行睾丸尖钳穿刺取精手术的患者1420例,观察其术后并发症发生情况,并给予针对性的治疗及护理。结果本组1420例睾丸尖钳穿刺取精手术患者均顺利完成手术,手术时间8～15min,平均(10.25±1.62)min。患者均发生疼痛,发生率100.00%;晕厥14例,发生率0.99%;睾丸血肿10例,发生率0.70%;感染3例,发生率0.21%。均经对症治疗护理后康复。结论护理人员应依据患者并发症发生的原因,做好术前、术中、术后并发症预见性预防及护理工作,其对预防及减轻患者并发症具有重要的意义。

array CGH和SNP array技术在胚胎植入前遗传学诊断中的应用比较

目的:比较两种微阵列技术在不同时期活检及移植时机对染色体易位携带者行胚胎植入前遗传学诊断(PGD)对诊断结果及妊娠结局的影响。方法:对染色体易位携带者行PGD的152个活检周期资料进行回顾性分析,其中60个a CGH-PGD周期采用D3卵裂球活检并新鲜周期移植的策略,92个SNP-PGD周期采用滋养外胚层活检并冷冻周期移植的策略,将两组的诊断结果及妊娠结局进行比较。结果:SNP-PGD与a CGH-PGD在无胚胎移植周期方面无明显差异;在诊断正常率上,SNP-PGD高于a CGH-PGD,两者间差异有统计学意义;移植周期临床妊娠率方面,SNP-PGD高于a CGH-PGD,而早期流产及胎停率则低于后者。结论:采用滋养外胚层活检并冷冻周期移植可能有助于获得较好的妊娠结局。

不同GnRH-a制剂的长方案中卵巢刺激后E_2水平的动态变化

目的对比分析短效和长效GnRH-a制剂的长方案中卵巢刺激后E2水平的动态变化,为临床促排卵过程中药物剂量的调整提供依据。方法回顾性分析2014年1月1日~2014年9月30日在本院生殖医学中心使用GnRH-a长方案的IVF/ICSI/胚胎植入前遗传学诊断（PGD）理想周期资料。纳入标准：年龄≤35岁,促排卵过程中没有进行促性腺激素剂量（Gn）的调整,获卵数在11~15个,促排天数在9~13d。按照降调节制剂剂型的不同,将纳入研究的88个周期分为短效长方案组（A组,共34个周期）和减量长效长方案组（B组,共54个周期）,对比分析两组在启动日、促排第5天、第8天以及HCG日E2水平的变化。结果 A组总促排卵天数显著短于B组[（10.2±1.4）vs.（11.3±1.1）d],Gn使用总剂量也显著低于B组[（1 766.8±524.6）vs.（2 134.9±603.6）U]（P〈0.05）。A组促排第5天E2水平[（1 236.0±646.7）vs.（739.0±482.4）pmol/L]及促排第8天E2水平[（5 043.1±2 611.4）vs.（3 885.1±2 345.7）pmol/L]均显著高于B组（P〈0.05）,HCG日两组E2水平无显著差异,平均每个卵的E2水平无显著差异（P〉0.05）。A组和B组的临床妊娠率分别为68.2%和71.8%,胚胎植入率分别为40.4%和48.8%,差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论长方案中GnRH-a制剂的类型影响卵巢刺激后E2水平的动态变化。

慢性子宫内膜炎的内膜免疫状态

慢性子宫内膜炎(chronic endometritis,CE)是一种以病原体感染为主要病因的子宫内膜慢性、持续性炎症,与不孕及辅助生殖助孕的不良妊娠结局密切相关。虽然目前应用抗生素治疗后CE患者的妊娠结局得到较大程度改善,但仍有部分持续性CE患者的病因未明、治疗效果不佳。越来越多的研究提示CE子宫内膜的免疫状态发生改变,并可能参与子宫内膜容受性降低和不良妊娠结局的病理过程。CE的免疫状态改变主要表现为以子宫自然杀伤细胞(uterine natural killer cell,uNK细胞)、巨噬细胞为代表的固有免疫细胞和以B细胞、CD4^(+)T细胞为代表的适应性免疫细胞的数量改变,CD4^(+)T细胞亚群比例失调,细胞因子和趋化因子表达异常。综述CE免疫状态改变的研究进展,以期从免疫角度加深对CE的病理特征和可能影响妊娠结局的内在机制的理解。

微阵列芯片比较基因组杂交技术在染色体易位携带者胚胎植入前遗传学诊断中的应用

目的 探讨微阵列芯片比较基因组杂交（aCGH）技术用于染色体易位携带者胚胎植入前遗传学诊断（PGD）的效果.方法 2012年1月至2013年6月在中山大学附属第一医院生殖中心共对151对染色体相互易位和62对罗氏易位携带者夫妇进行220个周期的PGD,其中应用aCGH技术对染色体相互易位和罗氏易位携带者行PGD的周期数分别为33和22个周期,应用荧光原位杂交（FISH）技术对染色体相互易位和罗氏易位携带者行PGD的周期数分别为119和46个周期.比较两种检测方法的诊断率.结果 应用aCGH技术对染色体相互易位和罗氏易位携带者易位染色体正常或平衡胚胎检出率分别为38.20％ （123/322）及67.20％ （127/189）,FISH技术分别为15.39％（195/1 267）及30.75％ （202/657）,aCGH技术的检出率均显著高于FISH技术（P均＜0.05）.应用aCGH技术对染色体相互易位和罗氏易位携带者易位染色体的异常胚胎检出率分别为59.32％（191/322）及30.69％ （58/189）,FISH技术分别为83.03％（1 052/1 267）及67.43％ （443/657）,aCGH技术均显著低于FISH技术（P均＜0.05）.aCGH技术检测的染色体相互易位携带者胚胎中,易位染色体正常或平衡、而非易位染色体发生非整倍体改变的异常胚胎检出率为20.19％（65/322）,明显低于罗氏易位携带者的38.62％ （73/189）,两者比较,差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 aCGH技术进行染色体易位携带者PGD的易位染色体正常或平衡检出率较FISH技术更高,而相互易位携带者的胚胎中非易位染色体发生非整倍体改变的异常胚胎检出率较罗氏易位携带者低.

国外代孕现状及其管理

代孕(surrogacy)是指委托夫妇在具备临床指征前提下,授权代理孕母完成与委托夫妇有或没有遗传联系的胚胎的妊娠及分娩过程。根据代理孕母与胚胎有或没有遗传联系,可将代孕分为完全代孕和部分代孕。我国卫生和计划生育委员会禁止任何形式的代孕。国外不同国家对代孕指征、代理孕母筛查标准各异。法律监管模式分为完全禁止型、政府管制型和私法自治型。代孕面临的问题主要集中在代孕儿抚养监护权的认定、代孕费用标准、代孕儿对代理孕母是否应尽赡养义务及伦理等方面。

子宫内膜血流异常是胚胎反复种植失败的相对独立风险因素

目的比较胚胎反复种植失败(recurrent implantation failure,RIF)患者与非RIF患者的超声下子宫内膜血流情况。方法采用前瞻性观察性队列研究,选择2019年2月至2019年7月期间于中山大学附属第一医院生殖医学中心进行冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)周期助孕的不孕症患者,通过经阴道彩色多普勒超声检测85例RIF患者及17例非RIF患者子宫内膜有无内膜下血流,比较未检测出内膜血流信号的患者比例,以及子宫内膜血流搏动指数(pulsatility index,PI)和阻力指数(resistance index,RI)。结果RIF组和非RIF组相比,超声检测出内膜血流信号的患者比例明显减少[65.88%(56/85)比94.12%(16/17),P=0.020];在能检测出内膜血流信号的患者中,RIF组的PI和RI值明显高于非RIF组(0.8959±0.1820比0.7791±0.2719,P=0.048;0.5756±0.0784比0.5111±0.1307,P=0.016);通过单因素logistic回归分析显示能否检测到内膜血流是RIF的独立风险因素(P=0.045)。结论子宫内膜血流异常可能与RIF有关,可能通过降低内膜对胚胎的容受性从而引起RIF的发生。

薄型子宫内膜患者冻融胚胎移植两种内膜准备方案临床妊娠率比较研究

目的比较薄型子宫内膜患者行冻融胚胎移植(FET)时自然周期(NC)、激素替代周期(HRT)两种内膜准备方案的临床妊娠率。方法选取2012年1月至2018年12月中山大学附属第一医院生殖医学中心人绒毛膜促性腺激素(hCG)扳机日子宫内膜厚度≤7mm、行FET患者为研究对象,根据内膜准备方案分为NC组和HRT组,使用倾向得分匹配方法成功匹配117对,匹配变量为年龄、移植胚胎类型、移植胚胎数目,比较匹配后两组的胚胎种植率、临床妊娠率。结果 NC组、HRT组的胚胎种植率(36.47%vs. 39.03%)、临床妊娠率(44.40%vs. 52.10%)比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论薄型子宫内膜患者FET内膜准备方案中,NC周期与HRT周期临床妊娠率无差异,临床上可根据患者自身特点选择合适的方案。