RhoA/ROCK信号通路对TLR-2配体诱导的类风湿关节炎患者成纤维滑膜细胞分泌趋化因子的调控作用

目的 研究RhoA/Rho激酶（ROCK）信号通路对Toll样受体2（TLR-2）配体诱导的类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLS）分泌趋化因子的影响.方法 RA FLS来源于活动性RA患者滑膜组织;肽聚糖被用于TLR-2配体;RhoA活性检测采用pull down方法;ROCK活性用磷酸化肌球蛋白结合亚单位1（MYPT1）蛋白表达来表示,磷酸化MYPT1蛋白检测采用免疫印迹法;细胞活性检测采用四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法,趋化因子水平采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测.结果 肽聚糖（5 mg/L）刺激使体外培养的RA FLS分泌白细胞介素8（IL-8）、单核细胞趋化蛋白-2（MCP-2）和受激活调节正常T细胞表达和分泌因子（RANTES）明显增高,对RhoA和ROCK活化也有显著的刺激作用,肽聚糖诱导的上述作用能被TLR-2单克隆抗体所阻抑.RhoA抑制剂C3转化酶和ROCK抑制剂Y27632对PG诱导的IL-8、MCP-2和RANTES等趋化因子分泌有显著的抑制作用.结论 RhoA/ROCK信号通路对TLR2介导的RA FLS分泌趋化因子具有调控作用,通过抑制该通路活化可能有利于RA的治疗.

Rho激酶抑制剂对类风湿关节炎患者滑膜单核巨噬细胞分泌炎症因子的影响

目的研究类风湿关节炎（RA）患者关节滑膜单核巨噬细胞Rho激酶（ROK）活化情况，并探讨该激酶抑制剂对滑膜单核巨噬细胞分泌炎症细胞因子的影响。方法单核巨噬细胞分离采用Ficoll密度梯度离心法和黏附法；ROK活性用磷酸化MYPT1蛋白表达来表示，磷酸化MYFT1蛋白检测采用免疫印迹法，单核巨噬细胞活性检测采用MTT法，细胞因子水平采用ELISA检测。结果新鲜分离的RA患者关节滑液单核巨噬细胞ROK活性显著高于自身配对的和正常对照组外周血单核细胞；新鲜分离的RA患者滑液单核巨噬细胞磷酸化MYPT1表达量与RA患者DAS28评分呈正相关关系（r=0．69，P〈0．05），ROK抑制剂Y27632在抑制RA滑膜单核巨噬细胞ROK活性的同时，对肿瘤坏死因子（TNF）α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6等炎症细胞因子分泌也有显著抑制作用，但对抗炎细胞因子IL—10分泌没有影响。结论RA滑液巨噬细胞中ROK处于异常活化状态，并与RA疾病活动有关。ROK特异性抑制剂对RA滑液巨噬细胞分泌多种炎症细胞因子均有抑制作用，提示ROK可能是治疗RA滑膜炎症的潜在靶点。

敲低NPHP1表达诱导犬肾集合管上皮细胞发生上皮间质转分化

目的研究敲低NPHP1基因表达对。肾小管上皮细胞特性的影响。方法靶向siRNA干扰技术敲低犬肾集合管上皮细胞（MDCK细胞）NPHP1的表达。实验分为空白对照组、阴性对照组、siRNA干扰组。显微镜下观察细胞形态和迁移能力；实时定量PCR和明胶酶谱法分别检测基质金属蛋白酶2和9（MMP2、MMP9）的mRNA表达和酶活性；实时定量PCR、Western印迹和细胞免疫荧光检测上皮钙黏素（E-cadherin）、β联蛋白（β-catenin）、闭锁小带蛋白1（ZO-1）、ZO-1相关核酸结合蛋白（ZONAB）及成纤维细胞标志蛋白仅平滑肌肌动蛋白（仪．SMA）的表达和分布。结果与对照组比较，靶向siRNA干扰24h，MDCK细胞迁移能力增强，E-cadherin、β-catenin、ZO-1的mRNA表达下降（均P〈0．01），α-SMA、MMP2、MMP9及ZONAB的mRNA表达均升高（均P〈0．05）；干扰48h见细胞变梭长形，E-cadherin、B-catenin、ZO-1的蛋白表达均下降（均P〈0．01），ZONAB、d．SMA蛋白表达升高（均P〈0.05），MMP2、MMP9活性升高（均P〈0．01）；干扰72h，可见细胞膜上β-catenin、E-cadherin表达明显减少，呈现断续改变或完全缺失，部分细胞可见α-SMA表达，ZONAB在细胞质和细胞核显著表达。结论敲低NPHPl表达可诱导MDCK细胞发生上皮间质转分化，激活ZO-1／ZONAB信号通路。这些改变可能与I型肾单位肾痨肾间质纤维化发生有关。