稳定过表达外源p62/SQSTM1基因的U937白血病细胞株的建立及初步特性分析

【目的】构建稳定过表达外源p62/SQSTM1基因的人急性单核细胞白血病U937细胞株,并初步分析过表达p62基因对U937细胞的影响。【方法】首先在空载体MSCV-IRES-GFP(MIG)基础上构建重组质粒MSCV-p62-IRES-GFP(MPIG),分别用MIG及MPIG载体进行病毒包装,并感染U937细胞,用流式细胞分选仪分选出绿色荧光细胞,获得U937-GFP和U937-p62稳定细胞株,利用流式细胞仪及Western blot分别检测GFP细胞的阳性率及p62蛋白表达水平,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定U937-GFP和U937-p62细胞的生长情况,流式细胞术检测髓系细胞表面分化抗原CD11b和CD14的表达情况。【结果】荧光显微镜观察结果显示,MIG和MPIG病毒感染后,U937-GFP和U937-p62细胞均表达绿色荧光蛋白;经流式细胞仪分选后,U937-GFP和U937-p62细胞中GFP阳性表达率分别达98.5%和87.3%。Western blot的结果显示U937-p62细胞中p62蛋白表达较U937-GFP显著升高。MTT实验结果显示,与U937-GFP细胞相比,U937-p62细胞的生长速率加快。流式结果显示U937-GFP细胞和U937-p62细胞表达细胞表面分化抗原CD11b及CD14无明显差异。【结论】成功构建了p62基因过表达的U937稳定细胞株,过表达p62可促进U937细胞增殖,并不能促进U937细胞的分化。

FMS样酪氨酸激酶3内部串联重复突变与急性髓细胞性白血病预后

近年来，鉴定同急性髓性白血病（AML）患者预后相关的获得性分子生物学标记取得了较大进展，增补了当前根据细胞遗传学异常制定的危险分层标准。FMS样酪氨酸激酶3基因内部串联重复突变（FLT3-ITD）作为最早发现的白血病分子生物学标记之一，其存在与高白细胞血症、完全缓解后高复发率及低存活率之间的关联性已被广泛接受。目前，大量研究正进一步揭示FLT3一｜TD对预后影响的确切机制。FLT3-ITD及活化型FLTE受体也因共同预后密切相关而成为治疗AML极具前景的靶点。

冬凌草乙素对白血病K562细胞的诱导凋亡作用及机制研究

目的：探讨冬凌草乙素（ponicidin,PON）对白血病K562细胞的诱导凋亡作用及其作用机制。方法：以不同浓度的PON（10~50μmol.L-1）作用于体外培养的K562细胞24,48,72 h,应用MTT法检测细胞生长抑制率,收集药物作用72h后的细胞Annexin V染色并通过流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率,瑞氏-姬姆萨染色观察细胞凋亡时的形态学变化。应用免疫印迹法（Western blot）检测caspase-3及其裂解底物多聚（ADP-核糖）聚合酶PARP的表达水平,并对MAPKs（mitogen-acti-vated protein kinase）信号转导通路相关蛋白（p-P38,p-ERK和p-JNK）以及PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）/AKT信号通路中的p-AKT,p-P85蛋白的表达水平进行检测。结果：30μmol.L-1以上的PON可显著抑制细胞的生长,并呈现出明显的量-效与时-效关系,FCM检测结果表明,不同浓度的药物作用72 h后,随药物浓度的增加细胞凋亡率逐渐升高,50μmol.L-1的PON作用不同时间后在瑞氏-姬姆萨染色下可见典型的核浓缩及核碎裂等细胞凋亡现象。Western blot检测结果表明,药物作用48 h后caspase-3被活化出现17 kD的亚单位,同时PARP被裂解出现89 kD的亚单位片段。Western blot检测结果进一步显示药物作用48 h后MAPKs信号途径中p-P38,p-ERK和p-JNK蛋白的表达水平无明显变化,而PI3K/AKT信号通路中的p-AKT,p-P85蛋白的表达水平则随着药物浓度增加而逐渐下降。结论：PON可以通过诱导白血病K562细胞调亡而发挥体外抗白血病作用。PON对K562细胞的诱导凋亡作用机制与caspse-3的活化以及降低PI3K/AKT信号通路中p-AKT及p-P85蛋白的表达水平有关,而与MAPKs信号通路中的相关调节蛋白无关;这些研究结果为进一步研究冬凌草素的抗白血病作用提供了有力的实验依据和技术平台。

环格列酮通过PPARγ及P38 MAPK信号途径诱导白血病HL-60细胞凋亡

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激动剂环格列酮（CGZ）对白血病HL-60细胞的增殖抑制作用及其作用机制.方法 以不同浓度的CGZ（10～50μmol/L）作用于体外培养的HL-60细胞24、48、72 h,应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞生长抑制率,琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡时的DNA梯状条带,流式细胞术（FCM）及膜联蛋白V（Annexin-V）/碘化丙啶（PI）双染色法检测CGZ单独及联合PPARγ拮抗剂GW9662作用后细胞凋亡率的变化,反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western印迹检测药物作用后PPARγ表达水平的变化,并对半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路相关蛋白的表达水平进行检测.结果 30 μmol/L以上的CGZ可显著抑制细胞的生长,并呈现出明显的量-效与时-效关系.药物作用后72 h50 μmol/L CGZ对细胞的生长抑制率为84%±11%,明显高于40、30μmol/L CGZ对细胞的生长抑制率（72%±13%、59%±13%,P＜0.01）,而且药物作用72 h后在琼脂糖凝胶电泳上可见典型的DNA梯状条带.RT-PCR及Western印迹结果表明,作用72 h后随着药物浓度的升高,PPARγ mRNA及蛋白的表达水平均逐渐升高,5μmol/L GW9662可以部分阻滞PPARγ的表达.FCM检测结果显示,CGZ（50 μmol/L）诱导的细胞凋亡只能部分被GW9662所阻滞（药物作用后72 h,CGZ诱导的细胞凋亡率为49.7%,CGZ＋GW9662的细胞凋亡率为36.2%,未加药对照组为3.2%）.Western印迹检测结果显示,MAPK信号途径中磷酸化P38（p-P38）的表达水平随药物浓度逐渐升高,同时caspase-3被活化出现相对分子质量为20 000的亚单位.结论 CGZ可以通过PPARγ依赖性和非依赖性途径诱导HL-60细胞凋亡,通过caspase-3活化以及激活P38 MAPK信号途径是CGZ诱导白血病HL-60细胞发生凋亡的重要作用机制之一.

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对白血病HL-60细胞的体外增殖抑制作用及机制的探讨

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂匹格列酮(PGZ)对白血病HL-60细胞的体外增殖抑制作用及其作用机制。方法以不同浓度的PGZ(20～80μmol/L)作用于体外培养的HL-60细胞24h、48h及72h,MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞周期及细胞凋亡。应用RT-PCR及免疫印迹法(Westernblot)检测药物作用后PPARγ、Caspase-3及其裂解底物多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)表达水平的变化。结果 PGZ可显著抑制细胞的生长及诱导细胞发生凋亡,呈现出明显的量-效与时-效关系。FCM检测结果表明,细胞主要被阻滞在G0/G1期,60μmol/L的PGZ作用48h后可以出现典型的亚G1期峰(细胞凋亡峰),PGZ在诱导细胞凋亡的同时,PPARγmRNA及蛋白的表达水平均逐渐升高。RT-PCR表明,Caspase-3酶原及其作用底物PARP表达水平逐渐降低,Westernblot结果显示32kD的Caspase-3酶原被活化出现17kD亚单位片段,同时Caspase-3的底物PARP被裂解出现89kD的亚单位片段。结论 PGZ在体外对HL-60细胞具有显著的细胞周期阻滞作用,并诱导细胞发生调亡。通过依赖PPARγ信号途径以及激活Caspase-3可能是PGZ抑制细胞增殖及诱导细胞发生凋亡的重要作用机制之一。