联合使用干细胞因子、FLT3配基与白介素2,7,15体外扩增人脐血来源CIK/NK细胞

通过干细胞因子 (SCF)、FLT3配基 (FL)联合白介素 (IL) 2 ,7,15等的不同组合体系体外扩增人脐血来源的CIK NK细胞 (CB CIK NK) ,探讨不同培养方式对CB CIK NK细胞诱导、扩增产率的影响。按诱导扩增体系的不同分 3组 :A组 (SCF +IL2 +IL7+IL15 ) ,B组 (SCF +FL +IL2 +IL7+IL15 )和C组 (IL2 +IL7+IL15 ,对照组 ) ,培养 2 1天 ,检测CD3+ CD5 6 + CIK细胞、CD3- CD5 6 + NK细胞比例和扩增倍数。结果表明 :经 2 1天培养 ,A ,B及C组CIK细胞比例分别为 (19.84± 2 .93) %、(2 6 .2 0± 4 .0 5 ) %及 (2 4 .0 3± 4 .99) % ;而NK细胞的比例A、B及C组比例分别为 (4 9.6 0± 1.4 0 ) %、(5 1.16± 6 .4 5 ) %及 (30 .85± 8.12 ) %。含SCF +FL的B组扩增效率最高 ,其中CIK细胞的扩增倍数由对照组 (C组 )的 (5 75 81± 2 2 1.72 )倍增加至 (796 .0 9± 2 78.4 7)倍 (最高为 1313倍 ) ;NK细胞由对照组 (C组 )的 (30 .39± 14 .4 7)倍增加至 (6 5 .85± 30 .83)倍 (最高为 12 1.0 6倍 )。结论 :通过合适的细胞因子组合可以同时扩增CB来源的CIK NK细胞 ;联合诱导、扩增CB CIK NK细胞以采用含SCF +FL +IL2 +IL7+IL15的培养体系为佳。

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

[目的]探讨体外培养定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的潜能。[方法]取大鼠下肢骨骨髓,分离培养MSCs,用5-氮胞苷(5-aza)定向诱导24 h,相差显微镜下观察其形态变化,免疫组化法检测肌钙蛋白(cTnT)和心肌细胞结蛋白(desmin)表达,并通过RT-PCR对肌球蛋白重链(MHC)在细胞中的表达进行鉴定。[结果]MSCs经5-aza诱导后,部分细胞呈梭形,并可见肌管样结构。免疫组化检测示诱导后MSCs的cTnT阳性细胞数为15％,Desmin表达强阳性,RT-PCR示诱导后MSCs有MHC表达。[结论]MSCs在体外能在一定条件下被诱导分化为心肌样细胞,是心肌缺血干细胞移植的较理想的细胞来源。

肝细胞生长因子诱导骨髓间质干细胞分化为心肌细胞

目的 :探讨肝细胞生长因子 (HGF)体外诱导骨髓间质干细胞 (MSC)定向分化心肌细胞的一种新方法。方法 :分离SD大鼠骨髓MSC ,培养至 4 - 6代后 ,添加HGF(终浓度 10 μg/L)持续培养 30d ,倒置显微镜下动态观察分化细胞的自律性搏动和对 0 1%异丙肾上腺素和无Ca2 + 孵育液的反应 ,并行心肌肌凝蛋白表达鉴定。结果 :分化第 14 - 2 0d骨髓间质干细胞增殖形成集落 ,10 % - 5 0 %克隆中开始出现持续节律收缩的细胞群体 ,节律频率为 70- 90次 /min ,异丙肾上腺素加快其搏动速率 ,无Ca2 + 孵育液则抑制之。细胞心肌肌凝蛋白表达鉴定为心肌细胞。结论 :HGF可诱导骨髓间质干细胞分化为心肌细胞 。

胎肝造血期胎肝间充质干细胞的分离、培养及生物学特性

【目的】分离、培养人胎肝造血期胎肝间充质干细胞(MSC),研究其生长特性及表面标记的表达。【方法】取孕16～20周人胚胎肝脏,分离培养胎肝MSC,传代培养成系并检测其增殖能力,应用流式细胞术、免疫荧光方法检测其造血相关表面标记和细胞蛋白表达。【结果】人胎肝MSC呈成纤维样形态,指数生长期倍增时间约为16h,细胞增殖26.5倍。传代15次仍有94.18%的细胞处于G0/G1期。流式细胞仪检测结果显示人胎肝MSC表达CD29、CD44、CD105、CD106和CD166,不表达CD31、CD34、CD45,不表达与GVHD相关的HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L。免疫荧光检测结果显示胎肝MSC表达造血微环境细胞外基质蛋白Fibronectin、α-SMA及上皮细胞标记蛋白AFP和E-cadherin。【结论】人胎肝MSC具有胚胎造血组织和发育中的肝脏特异的相关分子表达,免疫原性弱,可以作为研究造血、胎肝发育机制的模式细胞。

体外定向诱导人胚胎干细胞分化为表皮样干细胞的研究

[目的]探索体外定向诱导人胚胎干细胞(hES细胞)分化为表皮样干细胞的条件,为研究其定向分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将人胚胎干细胞单独(对照组)或与人羊膜上皮面向上全铺或半铺布半孔底共培养4～5 d,观察其形态变化并分别用β1整合素,CK15及CK19免疫组化检测人胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化.[结果]人胚胎干细胞与人羊膜共培养4～5 d后,在人羊膜上皮面形成表皮样干细胞集落,表达高水平的表皮干细胞特异标记物β1整合素、CK15和CK19.在无羊膜覆盖处,细胞贴壁生长,形成单层表皮样细胞,细胞呈多边形,排列紧密,大部分细胞表达β1整合素.对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞.[结论]在体外人羊膜可定向诱导人胚胎干细胞分化为表皮样干细胞,并提示在羊膜上皮面的细胞克隆可能是表皮样干细胞,而贴壁生长的细胞可能大部分是表皮样瞬间放大细胞.

含人AGM区基质细胞培养体系定向诱导胚胎干细胞为造血干细胞的实验研究

目的:体外模拟胚胎早期AGM区造血微环境,诱导胚胎干细胞(ESCs)分化为造血干细胞(HSCs)。方法:将小鼠E14ESCs在含BMP-4及VEGF的半固体培养基中诱导为拟胚体(EB),分别于3、6、9、12、15d时收获EB,流式细胞术检测Flk-1+细胞含量。取Flk-1+细胞处于高峰期的EB细胞,在人AGM区基质细胞饲养层上进一步诱导分化,并设无饲养层对照,分别于3、6、9、12d时收获细胞计数、流式细胞术检测Sca-1+c-kit+细胞含量,并分析造血细胞集落形成能力。结果:诱导E14细胞形成EB过程中添加BMP4+VEGF的因子组Flk-1+细胞在第9d达峰值(27.53%±2.84%),与未添加因子组(8.77%±1.12%)比较差异显著(P<0.05)。将培养9d的EB细胞在hAGMS3、hAGMS4饲养层上进一步诱导分化,第6d时Sca-1+c-kit+细胞达峰值,分别为7.31%±1.21%、7.62%±1.52%,其绝对数分别扩增(2.57±0.48)倍、(2.35±0.36)倍,与无饲养层组比较显著差异(P<0.05)。该分化阶段的Sca-1+c-kit+细胞具有形成各系造血细胞集落的能力。结论:人胚早期AGM区基质细胞能促进小鼠ESCs定向分化为HSCs,为研究ESCs分化为HSCs的分子机制提供了实验模型。

体外诱导胚胎干细胞分化为甲状腺细胞的实验研究

目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞(ESCs)分化为甲状腺细胞的可行性及相关分子表达检测。方法 E14小鼠 ESCs 诱导发育为胚胎体,再逐步添加 TSH、胰岛素、碘化钾(KI)等共同培养。以培养的小鼠甲状腺细胞为阳性对照,观察分化过程中细胞形态变化;用免疫荧光法检测分化标志物 TSH 受体(TSHR)、paired box gene 8(PAX8)、thyroid transcription factor-2(TW-2)、thyroidtranscription factor-1(TTF-1)的表达;RT-PCR 法检测分化相关基因 TSHR、PAX8、钠碘同向转运体(NIS)、过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白(Tg)的表达。结果诱导培养第6天分化细胞中存在甲状腺细胞特有基因 PAX8、NIS、TPO、Tg、TSHR 的表达;第8天分化细胞中检测到甲状腺细胞标志物TSHR、TTF-1、PAX8、TTF-2的表达,阳性细胞形态类似对照组甲状腺细胞。结论 ESCs 经胚胎体发育阶段,在特定条件下可定向分化为甲状腺细胞。

BMP-4与VEGF促进拟胚体中原始造血干细胞发生的实验研究

本研究旨在探讨骨形态发生蛋白-4(BMP-4)和血管内皮生长因子(VEGF)在诱导胚胎干细胞(ESC)形成拟胚体(EB)过程中促进原始造血干细胞形成的作用。将小鼠E14 ESC在半固体培养基中诱导为EB,根据培养体系中有无添加因子分组:未添加因子的自然分化组、含不同浓度(5、15、25、50 ng/ml)的BMP-4组,在BMP-4单因子实验的基础上联合10 ng/ml VEGF组及单因子VEGF组。分别于3、6、9、12、15天时收获EB,用流式细胞术检测Flk-1+细胞含量。结果表明:随着添加BMP-4因子浓度的逐渐升高,EB中Flk-1+细胞形成比例也逐渐增加,在第3天(D3)和第6天(D6)两个时点,25 ng/ml BMP-4作用组Flk-1+细胞达到峰值,分别为(6.51±1.02)%和(7.70±1.12)%,与无BMP-4对照组及5 ng/ml组比较有统计学意义的差异(p<0.05)。然而在BMP-4浓度升高至50ng/ml条件下Flk-1+细胞形成比例有减少趋势。在BMP-4单因子实验的基础上,以25 ng/ml BMP-4联合10 ng/mlVEGF共同作用于ESC→EB诱导过程,Flk-1+细胞百分比明显提高,在9天达到峰值,为(27.53±8.14)%,与自发分化组[(8.77±2.35)%]及VEGF单因子组[(11.21±2.23)%]相比均有显著性差异(p<0.05)。结论:BMP-4和VEGF联合使用可促进EB中胚层原始造血干细胞的形成,为进一步模拟造血微环境定向诱导ESC造血分化提供了实验依据。

间充质干细胞对脐血CIK/NK细胞CD69表达及培养体系中T调节细胞量比的影响

本研究通过Transwell细胞隔离培养体系探讨骨髓源间充质干细胞(MSC)对脐血(CB)来源细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)/自然杀伤细胞(NK)CD69的表达以及对培养体系中CD4+CD25+T调节(Treg)细胞量比的影响。利用聚碳酯膜孔径0.4μm的Transwell隔离细胞培养系统将实验组分为隔离培养(Transwell)组和直接混合(mix-ture)培养组;将MSC和CIK/NK细胞按1:20、1:50和1:100的比例分别在Transwell组和mixture组中进行隔离和直接混合培养,每组6个重复孔;培养48小时后通过流式细胞术检测各组CIK/NK细胞上CD69的表达以及培养体系中CD4+CD25+细胞量比的变化。结果显示:加入MSC的实验各组CB-CIK细胞和NK细胞上表达的CD69比例均显著低于对照组(p值均<0.001).Transwell组中的CIK和NK细胞上表达的CD69,在MSC的高浓度组(1:20组)均显著低于低浓度组(1:50组和1:100组),其中CIK细胞组间的p值分别为0.046、0.020;NK细胞组间的p值均为0.000。mixture组中不同比例组间CIK细胞上表达的CD69无显著性差异,而NK细胞上CD69的表达在MSC的高浓度组(1:20组)均显著低于低浓度组(1:50组和1:100组)。加入MSC的CB-CIK/NK细胞体系中的CD4+CD25+细胞的量比不论在Transwell还是mixture组中均显著高于对照组(p值均<0.01);在Transwell组中,CIK/NK细胞体系中的CD4+CD25+细胞的量比在1:20组、1:50组均显著高于1:100组;在mixture各组中,CIK/NK细胞体系中的CD4+CD25+T调节细胞的量比均有显著性差异。MSC的高浓度组(1:20组),CIK/NK细胞体系中的CD4+CD25+细胞量比在mixture组显著高于Transwell组;而在MSC的低浓度组(1:50组和1:100组),2组体系中的CD4+CD25+细胞量比无显著性差异。结论:MSC能以直接接触或间接作用的方式抑制异基因CIK/NK细胞的活化,这可能与MSC能上调培养体系中的CD4+CD25+Treg细胞量比有关,且这种作用与MSC的数量呈浓度依赖关系。

人脐静脉间充质干细胞的分离培养及生物学特性鉴定

为了对人脐静脉间充质干细胞(MSC)进行分离培养及其生物学特性鉴定。采用胶原酶分步消化法获得人脐静脉间充质干细胞(hUVMSC2)并对其进行体外培养、形态学观察及绘制生长曲线;利用条件培养基诱导法分析该细胞分别向成骨细胞和脂肪细胞分化能力;流式细胞术检测细胞表面标志物CD54、CD105、CD29、CD166、CD44、CD31、CD34、CD49、CD106等表达情况。结果该细胞形态为梭形或成纤维样,不表达内皮来源的vWF因子。在不同诱导条件下,该细胞可分别向成骨细胞和脂肪细胞分化。hUVMSC2细胞表面表达CD54、CD105、CD29、CD166、CD44等间质细胞黏附分子,不表达CD31、CD34、CD49、CD106等内皮或造血细胞相关标志物。该细胞指数生长期倍增时间约为26h,在添加bFGF条件下可迅速增殖,指数生长期倍增时间缩短为16h。研究证实人脐静脉内皮层下存在间充质干细胞,采用分步酶消化法可同时分别获得单根脐静脉的内皮细胞和间充质干细胞。hUVMSC2间充质干细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞分化潜能并表达多种黏附分子。

骨髓腔输注异基因间充质干细胞对移植后大鼠骨髓间充质干细胞重建的作用

为了研究骨髓腔内注射(IBM)异基因间充质干细胞(MSC)对造血干细胞移植后大鼠骨髓MSC重建的作用,研究供体MSC植入状态以探讨MSCs的作用机制,将雌性F344胎鼠及新生鼠外周血(FNPB)及雄性F344大鼠BrdU标记骨髓MSC共移植入经致死量60Coγ射线预处理的雌性Wistar大鼠,其中FNPB均由IBM输注,MSC则通过IBM或尾静脉注射。观察受鼠存活状况、供体HSC植入水平及骨髓MSC恢复情况,并以PCR检测Y染色体和免疫荧光法检测受鼠骨髓MSC的来源。结果显示:两个FNPB+MSCs共移植组大鼠移植后60天均100%存活,两组比较生存率和供体HSC植入水平无统计学差异,但明显优于单纯FNPB移植组;移植后30天时各移植组受鼠骨髓MSC的增殖能力均未达正常水平,但MSC骨髓腔共移植组集落数(66.0±10.6)明显优于MSC骨髓腔和静脉共移植组及单纯FNPB移植组(p<0.01);移植后60天时,免疫荧光法检测供体BrdU标记的MSC显示仅在少部分受体发现供、受体源性MSCs嵌合,但两个共移植组存活受鼠均检测到供体MSC来源Y染色体。结论:异基因MSC输注可促进造血干细胞移植受者骨髓MSC恢复,尤以IBM输注为佳。

含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景:前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞。目的:模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件。方法:将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体(EB),并利用Transwell非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM+FL和EB/AGM+FL+BM共4组。共培养6d后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态。结果与结论:①EB/AGM+FL组和EB/AGM+FL+BM组收获细胞涂片均发现原始造血细胞。②拟胚体来源细胞经AGM区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+细胞明显升高(P<0.05)。③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组(P<0.05),而EB/AGM+FL、EB/AGM+FL+BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高。提示AGM+FL和AGM+FL+骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层。

按造血发育程序诱导小鼠胚胎干细胞为造血干细胞重建体内造血的实验研究

为研究小鼠胚胎干细胞(ESC)定向诱导分化为造血干细胞(HSC)在体内重建造血的功能,将小鼠E14ESC诱导为拟胚体(EB),EB细胞利用Transwell非接触共培养体系在人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞饲养层上依次诱导,收获各阶段EB细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,并接种于NOD-SCID小鼠以检测体内致瘤性。再将不同诱导阶段的EB来源细胞移植到经致死量60Coγ射线照射的BALB/c雌鼠,将受鼠随机分为5组:①AGM组,②AGM+FL组,③AGM+FL+BM组,④照射对照组,⑤正常对照组。观察各组生存率、造血重建和植入状况。结果显示:EB细胞经人AGM区和FL基质细胞共培养后Sca-1+c-Kit+细胞达到峰值(21.96±2.54)%;NOD-SCID小鼠在接种经人AGM区基质细胞诱导的EB细胞后可出现畸胎瘤,而接种经人AGM区+FL基质细胞诱导EB细胞后未见肿瘤形成;AGM组及照射对照组动物全部死亡,而AGM+FL组及AGM+FL+BM组生存率分别为77.8%、66.7%,移植后21天外周血象基本恢复,在存活受鼠检测到供体来源Sry基因。结论:按胚胎造血发育程序,体外经人AGM区、FL及BM基质细胞连续诱导小鼠ESC分化的HSC可安全、有效地重建体内造血。

骨髓腔内输注脐带血及间充质干细胞对大鼠免疫重建影响

目的探讨骨髓腔内(IBM)输注脐带血及骨髓间充质干细胞(BMSC)对移植后大鼠免疫重建的影响。方法雌性F344胎鼠及新生鼠外周血(FNPB)及雄性F344大鼠BMSC共移植经致死量60Coγ射线辐照的雌性Wistar大鼠,其中FNPB均由IBM输注,BMSC则通过IBM或尾静脉(IV)注射。观察受鼠存活状况、供体造血干细胞(HSC)植入水平、免疫细胞及功能恢复、移植物抗宿主病(GVHD)表现,并用PCR检测受鼠供体BMSC来源Y染色体。结果两共移植组60d均100%存活,生存率和供体HSC植入水平差异无统计学意义,但明显优于单纯FNPB移植组;骨髓腔共移植组外周血白细胞及粒单系细胞集落形成单位(CFU-GM)、混合集落形成单位(CFU-GEMM)集落产率恢复较快,14d显著高于其他组(P<0.05)。而单纯FNPB移植组各检测时点集落计数均明显低于共移植组(P<0.05),30dCD19+细胞比例亦明显低于正常;30d各移植组PHA、LPS诱导淋巴细胞增殖实验及单向混合淋巴细胞培养无明显差异;60d两共移植组存活受鼠均检测到供体BMSC来源Y染色体。结论 HSC与BMSC联合输注可促进受者免疫重建,尤以IBM输注为佳。

体外诱导胚胎干细胞向甲状腺细胞的分化(英文)

背景:胚胎干细胞来源于发育早期囊胚的内细胞团,适当条件下能在体外维持未分化状态、正常二倍体核型及无限增殖能力,且具有多向分化潜能,能够发育分化成机体3个胚层的所有类型细胞。目的:观察体外定向诱导胚胎干细胞分化为甲状腺细胞的可行性及相关分子表达检测。设计、时间及地点:以细胞为对象的观察实验,于2004-01/2006-12在中山大学附属第二医院脐血库完成。材料:孕12.5～14.5d的Balb/c孕鼠用于胚成纤维细胞饲养层的制备。E14小鼠胚胎干细胞细胞株由美国哈佛大学Dr.Xu教授惠赠。成年昆明种小鼠用于甲状腺细胞的提取。方法:将制备的鼠胚成纤维饲养层接种于E14小鼠胚胎干细胞进行扩增培养。将脱离饲养层细胞后呈稳定克隆生长的胚胎干细胞诱导发育为胚胎体,再逐步添加促甲状腺素、胰岛素、碘化钾等共培养。以培养的成年昆明种小鼠甲状腺细胞为阳性对照。主要观察指标:①观察分化过程中细胞形态的变化。②免疫荧光法检测分化细胞标记物TSHR,PAX8,TTF-2,TTF-1的表达。③RT-PCR法检测分化细胞相关基因TSHR、PAX8,NIS,TPO,Tg的表达。结果:分化细胞边界清晰,呈圆形、类圆形、梭形或多角形贴壁生长。诱导培养第6天分化细胞中有甲状腺细胞特有基因PAX8,NIS,TPO,Tg,TSHR的表达,第8天检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TSHR,TTF-1,PAX8,TTF-2的表达,阳性细胞形态类似对照甲状腺细胞。结论:胚胎干细胞经胚胎体发育阶段,在特定条件下可定向分化为甲状腺细胞。

AGM区来源的基质细胞促进造血干细胞扩增的体外实验研究

目的:探讨主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)来源的基质细胞对造血干细胞(HSC)增殖的促进作用,为探寻HSC的体外扩增方法奠定实验基础。方法:分别从孕11dBALB/c小鼠胚胎AGM区及6周龄小鼠骨髓分离、培养基质细胞,流式细胞仪等对基质细胞进行鉴定;利用小鼠胚胎干细胞(ESC)向造血细胞定向分化的模型,结合高增殖潜能集落(HPP-CFC)、原始细胞集落(BL-CFC)形成实验及流式细胞仪分析CD34+、CD34+Sca-1+细胞比例,对比研究AGM及骨髓基质细胞对ESC来源的HSC的扩增作用。结果:小鼠AGM和骨髓基质细胞在形态及表型上基本相似,均符合基质细胞的特征。AGM和骨髓基质细胞均可促进ESC来源的HPP-CFC的形成,但AGM基质细胞还可促进ESC来源的BL-CFC的形成;流式细胞仪检测发现:在骨髓基质细胞支持下,CD34+细胞增加了3-4倍,但CD34+/Sca-1+却无明显增加;而在AGM基质细胞支持下CD34+、CD34+Sca-1+细胞均明显增加了4-5倍。结论:AGM基质细胞在有效扩增小鼠HSC同时,能很好地维持HSC自我更新及多向分化的潜能。

人AGM区及胎肝基质细胞促进小鼠胚胎干细胞向造血干细胞分化和体内造血重建

目的:探讨小鼠胚胎干细胞(ESCs)经人主动脉-性腺-中肾(AGM)区及胎肝(FL)基质细胞程序诱导后,向造血干细胞(HSCs)分化的效率及其造血功能。方法:将E14 ESCs诱导为拟胚体(EB),并在人AGM区及FL基质细胞饲养层上进一步诱导分化,培养6 d后收集细胞检测Sca-1+c-Kit+细胞含量、分析造血细胞集落形成能力及致瘤性。再将不同诱导阶段的EB来源细胞移植经致死量[60Co]γ射线辐照的BALB/c雌鼠,观察生存率、植入状况和造血重建。结果:(1)EB来源细胞经人AGM区及FL基质细胞程序诱导后Sca-1+c-Kit+细胞含量为(21.96±2.54)%,造血集落总数为(520±52)/105cells,明显优于诱导前及人AGM区基质细胞初步诱导者(P<0.05)。(2)NOD-SCID小鼠接种经人AGM区及FL基质细胞诱导的ESCs未见畸胎瘤。(3)BALB/c雌鼠移植经人AGM区及FL基质细胞诱导的EB来源细胞后生存率77.8%,14 d外周血细胞计数明显改善,存活受鼠均检测到供体来源sry基因,而移植人AGM区基质细胞诱导的EB细胞者15 d内全部死亡。结论:人AGM区及FL基质细胞能促进小鼠ESCs定向分化为HSCs,有效重建体内造血功能。

含人AGM区基质细胞对小鼠胚胎干细胞诱导体外分化为造血干/祖细胞的作用

为探讨人主动脉一性腺一中肾(AGM)区基质细胞对小鼠胚胎干细胞(em bryonic stem cells,ESC)体外诱导分化为造血干细胞(HSC)的影响及其作用机制,将小鼠E14ESC诱导为拟胚体(EB),收获的EB细胞以Transw ell非接触共培养体系分别在人AGM区、胎肝(FL)或骨髓(BM)基质细胞饲养层上进一步诱导分化,分为EB对照、AGM诱导、FL诱导、BM诱导、AGM+FL诱导和AGM+BM诱导共6组。分别收获各组EB来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-K it+细胞含量,并进行各系造血细胞集落形成单位(CFU)分析。结果显示:经不同基质细胞饲养层诱导后EB来源细胞中Sca-1+c-K it+细胞比例均较诱导前明显升高(p<0.01),AGM+FL诱导组为(21.96±2.54)%,显著优于其它诱导组(p<0.01),AGM+BM诱导组阳性细胞比例亦较单纯BM诱导组明显增加(p<0.01);EB对照组造血集落产率明显低于其它诱导组,AGM+FL、AGM+BM诱导组集落产率较高,尤以AGM+FL诱导组最佳(p<0.01)。结论:人AGM区基质细胞有助于维持一定的原始HSC数目及高增殖潜能,在AGM区基质细胞诱导基础上可明显提高FL或BM基质细胞对ESC源性原始HSC的进一步扩增作用。

人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建

背景:研究证实多种造血生长因子、基质细胞饲养层及其条件培养液可促进胚胎干细胞向造血干细胞分化。目的:以人主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区基质细胞为饲养层体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞,并比较不同移植途径对造血干细胞体内造血重建能力的影响。方法:将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体,采用Transwell非接触共培养体系在人AGM区基质细胞饲养层上诱导6d,接种NOD-SCID小鼠检测体内致瘤性。再将诱导后的拟胚体细胞移植经致死量60Coγ射线辐照的BALB/C雌鼠,受鼠随机分为静脉移植组、骨髓腔移植组、照射对照组及正常对照组。结果与结论:拟胚体细胞经人AGM区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+细胞占(13.12±1.30)%。NOD-SCID小鼠皮下接种经人AGM区基质细胞诱导的拟胚体细胞可出现畸胎瘤,经骨髓腔接种未见肿瘤形成。静脉移植组动物全部死亡,骨髓腔移植组生存率为55.6%,移植后21d外周血象基本恢复,存活受鼠检测到供体来源Sry基因。提示小鼠胚胎干细胞经人AGM区基质细胞诱导分化的造血干细胞通过骨髓腔移植安全并具有一定的造血重建能力。

人AGM区基质细胞系的建立及其生物学特性

【目的】建立人主动脉鄄性腺鄄中肾(AGM)区基质细胞系,研究其生长特性及表面标志的表达。【方法】取孕30～35d的人胚胎分离培养AGM区基质细胞,传代培养成系并检测其增殖能力,应用流式细胞术、免疫荧光方法检测其造血相关表面标志和细胞外基质蛋白成分。【结果】人AGM区基质细胞呈成纤维样形态,指数生长期倍增时间约为16h。流式细胞仪检测结果显示CD31、CD34、CD45在人AGM区基质细胞表面为阴性表达,而CD29、CD44、CD105、CD166均为阳性表达。免疫荧光检测结果显示AGM区基质细胞表达细胞外基质蛋白Tenascin、Fibronectin、Laminin及α鄄SMA。【结论】人AGM区基质细胞系呈现造血组织特异的相关分子表达特征,可以作为研究造血发生机理的模式细胞。