快速个体识别STR分型技术

DNA-STR分型技术[1]一般包括DNA提取、PCR扩增、电泳分析三个部分,DNA提取需要1 h以上,PCR扩增需要3~4 h,电泳分析需要1 h以上,完整的DNA-STR分型需要6~8 h[2]。进一步缩短DNA-STR分型时间,实现快速DNA分析成为科研攻关的一个新的重点[3-5]。目前,快速DNA分析的研究主要集中在快速DNA提取和快速电泳分型两个部分。

AGCU Database Y30试剂盒技术指标评价及法医学应用

测试AGCU Database Y30试剂盒的六色荧光标记复合PCR检测体系,评估其技术指标及在法医学的应用价值。采集300份无关男性样本,对AGCU Database Y30试剂盒性能(灵敏度、稳定性、准确性、种属特异性,对男女混合样本、常见普通检材样本及建库样本的扩增能力)进行测试。该试剂盒检测样本准确,且灵敏度较高,最小检出量为0.125 ng;同一来源不同载体样本具有同一性、种属特异性高、抗抑制性效果良好,女性DNA或其他男性DNA存在下(19:1)仍然分型准确,且在不同批次试剂间结果稳定,对于血液痕迹、唾液、骨骼等不同常见检材样本的检测结果具有一致性,不同PCR环境均可获得完整分型。AGCU Database Y30试剂盒可应用于法庭科学实际检案与建库实验。

马STR复合扩增体系的建立和应用

本文为实现对马匹进行亲缘鉴定及个体识别,基于STR分型技术建立了一套包含20个STR基因座和1个性别识别位点的复合扩增体系,并对其进行性能评价以及实际样本扩增测试。应用荧光标记技术,选择HTG06、HTG07、COR022、CA425、HTG04、COR082、LEX54、COR069、AHT05、HMS03、HMS01、HMS06、HMS07、COR058、HTG10、ASB17、VHL20、HMS02、ASB02、LEX34、Amelogenin共21个遗传标记,进行引物设计、PCR复合扩增、CE平台测序,验证该体系的灵敏度、特异性及耐受性。对128份实际样本进行检测以及亲缘关系比对,并对其中的66份未知亲缘关系的样本基因做多态性统计。结果显示:该复合扩增体系检测128份马样本能够获得完整STR分型,在实际扩增中,无非特异峰产生,对于不同种属动物,例如牛、羊、猪、鸡、猫、狗、人DNA样本扩增时不出现特异性扩增峰;0.075 ng马标准品在10μL体系下仍可以获得完整分型;对于4种常见抑制剂的耐受性可以分别达到血红素200μmol/L、血红蛋白200μmol/L、腐殖酸100 ng/μL、EDTA 1.2 mmol/L。本研究建立的马STR复合扩增体系分型准确、性能优,可满足实验室对马匹亲权关系鉴定和个体识别的需求。

Evaluation of a Novel 32 X-STR Loci Multiplex System in the Forensic Application

The AGCU X Plus STR system is a newly developed multiplex PCR kit that detects 32 X-chromosomal STR loci simultaneously.These are DXS6807,DXS9895,linkage group 1(DXS10148,DXS10135,DXS8378),DXS9902,DXS6795,DXS6810,DXS10159,DXS10162,DXS10164,DXS7132,linkage group 2(DXS10079,DXS10074,DXS10075),DXS981,DXS6800,DXS6803,DXS6809,DXS6789,DXS7424,DXS101,DXS7133,GATA172D05,GATA165B12,linkage group 3(DXS10103,HPRTB,DXS10101),GATA31E08 and linkage group 4(DXS8377,DXS10134,DXS7423).A major advantage of this kit is that it takes into account linkage between loci,in addition to detecting more X-STR loci.In order to evaluate the forensic application of 32 X-STR fl uorescence amplifi cation system,PCR settings,sensitivity,species specifi city,stability,DNA mixtures,concordance,stutter,sizing precision,and population genetics investigation were evaluated according to the Scientific Working Group on DNA Analysis Methods(SWGDAM)developmental validation guidelines.The study showed that the genotyping results of each locus were signifi cantly accurate when the DNA template was at least 62.5 pg.Complete profi les were obtained for the 1∶1 and 1∶3 combinations.A total of 209 unrelated individuals from Southern Chinese Han community,consisting of 84 females and 125 males,were selected for population studies,and 285 allele profi les were detected from 32 X-STR loci.The polymorphism information content(PIC)ranged from 0.2721 in DXS6800,to 0.9105 in DXS10135,with an average of 0.6798.DXS10135(PIC=0.9105)was the most polymorphic locus,with discrimination power(DP)of 0.9164 and 0.9871 for the male and female.The cumulative PD_(F),PD_(M),MEC_(trio) and MEC_(duo) valu es were all greater than 0.999999999.There were 78 different DXS10103-HPRTB-DXS10101 haplotypes among the 125 males,and the haplotype diversity was 0.9810.There was no signifi cant difference in the cumulative PD_(F),PD_(M),MEC_(trio) and MEC_(duo) values whether considering linkage or not.In summary,the new X-STR multiplex typing system is effective and reliable,which can be useful in human genetic analysis and kinship testing as a potent complement to autosomal STR typing.

15个常染色体和10个Y-STR基因座复合扩增试剂盒的研发

目的建立法医物证学常染色体和Y染色体综合检测的方法。方法选择常用的常染色体STR基因座和Y染色体STR基因座,设计复合扩增引物,形成五色荧光标记复合扩增试剂盒。结果开发出一个五色荧光标记复合扩增试剂盒,可同时对15个常染色体STR基因座、1个性别基因座和10个Y染色体STR基因座进行分型检测。结论 15个常染色体STR加10个Y染色体STR检测试剂盒结合毛细管电泳凝胶进行STR分型,结果准确可靠,在法医学案件检验及数据库建设等方面有良好的应用前景。

湖北地区汉族人群24个Y-STR基因座遗传多态性研究

目的 对湖北汉族人群24个Y-STR基因座多态性进行调查,并获得相关的基础遗传学数据.方法 应用AGCU Y24 STR荧光标记复合直接扩增系统及3130XL型DNA测序仪,对湖北地区320对已确定父子关系的640个男性个体血样进行24个Y-STR检测分型.结果 在320名父亲男性个体中,在DYS391、DYS389工、DYS439、DYS389Ⅱ、DYS438、DYS449、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、Y-GATA-H4、DYS447、DYS19、DYS392、DYS522、DYS393、DYS388、DYS390、DYS444基因座在湖北地区汉族人群分别检出4～17个等位基因,DYS527a/b检出45个等位基因组,DYS385a/b检出57个等位基因组,各基因座基因多样性最低为0.3838,最高为0.9650;并检出320种单倍型.比对320对父子Y-STR分型,在7680次基因遗传传递中,在DYS449、DYS527、DYS444、DYS389Ⅱ、DYS447、DYS522、DYS385、Y-GATA-H4等10个基因座中检出16个突变,突变率为1.5625‰～1.5653％,平均突变率为2.0833‰;等位基因增加突变与等位基因减少突变比为1∶1.结论 24个基因座单倍型在湖北地区汉族人群中具有丰富的遗传多态性,其数据对法医学应用、Y-STR数据库建设和群体遗传学等研究应用具有重要意义.

miniSTR基因座及其检测系统在降解检材中的法医学应用

目的建立16个miniSTR基因座的复合扩增体系,探讨其在法医学降解检材中的应用价值。方法采用六色荧光标记技术,对16个miniSTR基因座进行复合扩增体系的构建及法医学应用评估。结果开发出一个六色荧光标记的miniSTR扩增试剂盒,可同时对15个常染色体STR基因座、Amelogenin基因座和DYS391基因座进行分型检测,方法特异性好,分型结果稳定、准确,灵敏度达50 pg,实际案件中常见生物检材的检验结果良好。结论 16个miniSTR复合扩增体系对降解与微量检材的检测具有应用价值,灵敏度高,具有数据库兼容性,可以用于实际案件检验。

Expressmarker 22 STR荧光检测试剂盒的法医学应用

目的验证Expressmarker 22 STR荧光检测试剂盒的法医学应用价值。方法取FTA卡、滤纸上保存的建库血样和各类涉案生物性检材1948份,用Expressmarker 22 STR荧光检测试剂盒进行STR分型检测,同时采用SinofilerTM、Identifiler、PowerPlex16试剂盒进行平行试验。对4个试剂盒相同基因座的分型进行比对,以确认Expressmarker 22 STR荧光检测试剂盒的灵敏度和准确性。结果 Expressmarker 22 STR荧光检测试剂盒的检测成功率为97.79%,同一样本在相同基因座与SinofilerTM、Identifiler、PowerPlex16试剂盒的STR分型结果相同。结论利用Expressmarker 22 STR荧光检测试剂盒进行STR分型,信息量大、结果准确可靠,可应用于法庭科学。

6+1 STR试剂盒和电泳凝胶EX-Q20用于DNA快速检验

目的建立快速个体识别STR分型方法。方法取采集于FTA上的血样200份,经打孔仪取等量血痕分别使用6+1 STR试剂盒结合新型毛细管电泳凝胶EX-Q20进行快速电泳分析和使用SinofilerTM试剂盒结合POP4胶进行电泳分析,比较两者所耗费时间和结果的差异。结果 6+1 STR试剂盒结合新型毛细管电泳凝胶能够得到全部分型结果且耗时较短。结论 6+1 STR试剂盒结合新型毛细管电泳凝胶进行STR分型,结果准确可靠,尤其适用于重特大案件中大量人员的排查、比对,能大大提高办案效率。

15个常染色体和18个Y染色体STR基因座复合扩增检测体系及法医学应用

目的建立15个常染色体和18个Y染色体STR基因座以及性别基因座的六色荧光标记复合PCR直扩检测体系,并评估其法医学应用价值。方法采用六色荧光标记技术,建立15个常染色体STR基因座(D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO、D19S433、v WA、D21S11、D18S51、D8S1179、D5S818、FGA)和18个Y染色体STR基因座(DYS527a/b、DYS448、DYS456、DYS385a/b、DYS458、DYS391、DYS390、DYS19、DYS438、DYS393、DYS389Ⅰ、DYS439、DYS389Ⅱ、DYS392、GATA、DYS635)以及Amelogenin的复合扩增体系,收集800份无关人员血样进行基因座检测,评估所建复合扩增体系的稳定性、灵敏度、种属特异性、直扩可行性以及抗抑制性。结果本检测体系对800份无关人员血样复合扩增后,结果准确,灵敏度达0.125ng;种属特异性高;38份案件检材全部准确分型。在对照男性与女性的DNA浓度比值大于等于1:4时,男性DNA的所有基因座均能准确分型。若模板DNA中含一定浓度的已知抑制剂时,所有基因座也均准确分型。结论本文建立的复合扩增检测体系可同时检测15个常染色体和18个Y染色体基因座以及性别基因座,结果稳定准确,灵敏度高,可为法医DNA检测分析提供一个新选择。

宁波地区非综合征型耳聋患儿耳聋基因热点突变筛查分析

目的筛查分析宁波地区非综合型耳聋(NSHL)患儿耳聋基因热点突变情况,了解该地区耳聋患儿分子流行病学特征。方法选取宁波市特殊教育中心就读的重度、极重度NSHL患儿168例,应用遗传性耳聋基因检测试剂盒,采用多重突变阻滞扩增系统毛细管电泳检测技术进行4个遗传性耳聋基因的29个位点的突变筛查。结果本研究NSHL患儿中检出耳聋基因热点突变58例(34.52%),其中单一GJB2基因热点突变者43例,单一SLC26A4基因热点突变者9例,GJB2基因合并SLC26A4基因热点突变者3例,12S rRNA基因热点突变3例;GJB2、SLC26A4、12S rRNA基因热点总突变率分别为27.38%、7.14%和1.79%。在所有热点突变中,以GJB2 235delC突变率最高(23.21%),其次是GJB2 299 del AT(5.36%)。结论宁波地区NSHL患儿热点突变耳聋基因以GJB2基因和SLC26A4基因为主,且GJB2 235delC是最常见突变位点。

16个线粒体DNA SNP复合检测体系的建立

目的建立一种复合检测线粒体DNA（mtDNA）单核苷酸多态性（SNP）分型的方法。方法通过设计等位基因特异性引物并结合毛细管电泳分型技术平台，建立包含16个mtDNASNP位点的复合扩增检测体系。对50名汉族无关个体血样进行mtDNASNP检测，并通过直接测序法对其分型结果进行验证。结果50个样本经本检测体系复合扩增后，均得到清晰的SNP分型结果，当模板量在0．5～10pg时能得到较理想的分型图谱。样本的复合检测结果与直接测序法结果完全一致。结论建立的复合检测体系检测mtDNASNP方法灵敏度高、操作简便、分型准确，为针对mtDNA进行简便、有效的中高通量多态性分型提供了一种新方法。

北京汉族群体中6个Y-STR遗传标记多态性调查

用PCR-PAGE技术调查了6个新的Y—STR基因座（DYS505、DYS533、DYS549、DYS576、DYS578和DYS641）在北京汉族群体中的分布，并评价他们在法医学中的应用价值，旨在筛选适合于法医学应用的新的Y—STR基因座。

23个STR基因座荧光复合扩增体系的法医学应用评估

目的评估新建立的23个STR复合扩增体系EX23的法医学应用价值。方法使用磁珠法提取样本DNA,应用23个STR复合扩增体系进行扩增,ABI3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID 3.2软件进行基因分型,对法医学应用参数、灵敏度、种属、脱落细胞检材及降级检材分型效果进行观察,并与Sinofiler试剂盒比较。结果 DNA模板量在0.05~1.00ng时,各基因座分型结果清晰准确,均衡性好、特异性强。应用该复合扩增体系检验混合样本、降解检材及脱落细胞检材,均能获得正确的分型结果。统计结果显示该23个STR基因座累计个人识别（TDP）率达0.999999999,三联体累计非父排除率（CPE）达0.999999997。结论新建立的23个STR复合扩增体系分型效果良好,在广东地区汉族人群中具有高度多态性,可满足日常法医鉴定的需要。

EX16+10Y试剂盒检测新疆维吾尔族人群的效能

目的检验EX16+10Y试剂盒在新疆维吾尔族人群中的法医学检测效能。方法采集4 620个新疆地区维吾尔族男性个体血样,用EX16+10Y试剂盒进行扩增,用3130xl基因分析仪对扩增产物进行分型。结果获得4 620个新疆维吾尔族男性个体的15个常染色体STR基因座和10个Y染色体STR基因座的完整分型图谱。15个常染色体STR基因座分布均符合Hardy-Weinberg平衡,STR基因座的杂合度为0.637~0.838,多态信息含量为0.580~0.860,个体识别率为0.811~0.978。10个Y染色体STR基因座有766种单倍型。结论 EX16+10Y试剂盒检测结果准确可靠,可用于实际工作中同时完成个体识别和男性家系排查。

猪骨组织的鉴定应用

目的对一份来源于案件现场的骨质样本,鉴定其种属来源。方法使用磁珠法提取骨质样本中的DNA,再经法医鉴定试剂盒AGCU Expressmarker22进行扩增,根据结果再以肉源种属鉴定试剂盒对提取的DNA进行扩增,判断其中的种属性成分,最后进行AGCU猪源性成分检测试剂盒荧光定量PCR复测。结果使用AGCU Expressmarker22扩增试剂盒对各基因座检测均无扩增峰出现,使用肉源种属鉴定试剂盒扩增显示其中含有猪源性成分,AGCU猪源性成分检测试剂盒荧光定量PCR复测结果证实其猪源性。结论所测骨质样本应为猪骨样本。

北京汉族群体中6个Y-STR遗传标记的多态性研究

目的:为了寻求新的适合于法医学应用的Y染色体STR基因座,调查了基因座DYS505、DYS533、DYS549、DYS576、DYS578和DYS641在北京汉族群体中的分布。方法:样本来自于北京地区汉族无血缘关系的个体,通过Chelex法提取样本DNA,利用PCR扩增硝酸银染色方法进行分型。结果:6个基因座均为四核苷酸简单重复基因座,男性样本都出现了谱带,而女性样本则无PCR产物。DYS505、DYS533、DYS549、DYS576、DYS578和DYS641基因座变异度分别为0.732、0.7824、0.6344、0.7124、0.7543和0.7314。结论:6个基因座都是非常适合于法医学应用的STR基因座。

47个常染色体InDel位点在中国5个民族中的遗传多态性及法医学应用

目的调查AGCU InDel 50试剂盒中纳入的47个常染色体插入/缺失(insertion/deletion,InDel)多态性遗传标记在中国广东汉族、广西壮族、广西瑶族、广西京族和广西仫佬族中的群体遗传学数据,并评估其在法医学DNA鉴定中的应用。方法采用AGCU InDel 50试剂盒对上述5个民族共768名无关个体的血样进行复合扩增,通过3500xL基因分析仪进行基因分型,统计群体遗传学参数,并进行多态性分析。结果在这5个民族中,47个常染色体InDel位点相互间均不存在连锁不平衡。在广东汉族和广西壮族中,47个常染色体InDel位点的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡;而在广西瑶族、广西京族、广西仫佬族中,除rs139934789位点外其余46个位点均符合Hardy-Weinberg平衡。群体间遗传差异分析结果显示1.12%的遗传变异是由民族差异造成。47个常染色体InDel位点在这5个民族中的累积个体识别率均高于0.999999999999999,累积非父排除率均小于0.9999。2个Y-InDel位点在所有男性个体中均被检出,在女性个体中均未被检出。结论除rs139934789位点外,其余46个InDel位点在这5个中国民族群体中具有较好的遗传多态性,可用于法医学个体识别或作为亲权鉴定的有效补充。

犬17A STR 5色荧光检测试剂盒在警犬DNA鉴定中的应用研究

目的建立犬DNA检测方法。方法采用自主研发的多重PCR扩增体系和五色荧光(FAM、HEX、TAMRA、ROX和SIZ)自动化检测技术调查了犬DAmel和VWFX等16个STR基因座和1个性别决定基因座多态性,并计算该16个STR基因座的等位基因频率(P)、杂合度(H)、多态信息含量(PIC)和非父排除率(PE)。实验犬为11个品种231头犬。结果结果显示该16个STR位点的非父排除率(PE)和个体识别力(DP)分别为0.995026和0.999999992。结论显示研发的犬STR-DNA荧光检测试剂盒可作为犬DNA鉴定常规应用。

SD大鼠死后心血中大肠杆菌DNA含量与早期死亡时间相关性的研究

目的探讨SD大鼠死后心血总DNA含量变化规律;研究大鼠死后心血中大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶基因(Lac Z基因)含量变化与PMI的相关性。方法用分光光度计检测SD大鼠死后96h内心血总DNA浓度变化;选择大肠杆菌LacZ基因上一段较为保守的序列,构建引物及探针,制备重组质粒标准品,利用qPCR技术检测大鼠死后96 h内心血中大肠杆菌LacZ基因浓度变化情况。结果随着PMI的延长,SD大鼠死后96h内心血DNA浓度呈线性增长趋势,其回归方程为:y=1.0233x+31.647,R^2=0.9345;大鼠死后0~48h LacZ基因扩增不明显,死后60~96h LacZ基因浓度呈指数式增长,其回归方程为:y=3E-06e^(0.1567x),R^2=0.9569。结论 SD大鼠死后96h内的心血总DNA含量变化及大肠杆菌LacZ基因含量变化均可用于推断PMI。