恶性疟原虫组蛋白甲基转移酶SET7催化结构域的表达及活性鉴定

目的:构建杆状病毒昆虫表达质粒pFast-N-set7cd、pFast-C-set7cd和无细胞麦胚表达载体pEUHis-set7cd,表达恶性疟原虫组蛋白甲基转移酶SET7催化结构域(Pf SET7cd),并鉴定PfSET7cd的组蛋白甲基转移酶活性。方法:通过分子克隆技术构建获得pFast-N/C-set7cd以及pEU-His-set7cd表达质粒,尝试通过杆状病毒传代方式与无细胞麦胚表达方式获得重组Pf SET7cd蛋白,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物,并进一步检测重组蛋白的酶活性。结果:用于昆虫表达的重组质粒pFast-N-set7cd、pFast-C-set7cd双酶切结果大小与测序结果均正确,但是Western blot并未检测到其在昆虫细胞中的可溶性表达产物;pEU-His-set7cd通过无细胞麦胚表达系统表达获得的蛋白与预测大小一致,经Western blot鉴定正确,并用NTA-Ni2+亲和层析纯化。体外酶活实验显示PfSET7cd具有催化H3第36位赖氨酸上三甲基化(H3K36me3)活性。结论:通过无细胞表达系统获得可溶性的PfSET7cd重组蛋白,PfSET7cd重组蛋白具有介导H3K36me3的活性,但不影响H3K4me3和H3K9me3水平。