中国医学分子微生物学的现状与展望

21世纪是以分子生物学为代表的生命科学的世纪,它将推动生物学由细胞水平向分子水平、基因水平发展。在分子微生物学基础研究方面,目前已搞清大肠杆菌基因约40%,已查明噬菌体的全部基因顺序,大约60%的基因亦已搞清。对某些细菌和病毒的复制、基因克隆、核苷酸序列,编码基因、增强子、启动子的结构与功能进行了深入的研究。在病原微生物检测技术方面,已由过去第一代的微生物常规分离培养技术,第二代的生化等快速诊断技术,第三代的单克隆抗体技术进入目前正在兴起的第四代基因诊断(基因探针和PCR)技术。前三代诊断技术都是以疾病的表型改变为依据。

人PSP94与TNFα衍生物联合治疗人前列腺癌的实验研究

构建了表达人 PSP94、TNFα衍生物 ( TNFα D1 1 a)及 PSP94与 TNFα D1 1 a( PSP94- TNFαD1 1 a)双功能蛋白真核表达质粒 pc DNA- TNFα D1 1 a、pc DNA- PSP94和 pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a,与 rh PSP94和 rh TNFα D1 1 a蛋白分别在人前列腺癌裸鼠移植瘤动物模型上进行了 PSP94与 TNFαD1 1 a联合治疗人前列腺癌的实验研究 .当动物肿瘤直径长至约 1 0 mm时 ,将以上 3种真核表达质粒分别以 50 μg/只的量给相应组动物的左右四头肌内注射一次 ,同时设 pc DNA3.0空载体对照组 ;rh PSP9450μg/kg、rh TNFαD1 1 a 1 0 0万单位 /kg、rh PSP94和 rh TNFαD1 1 a以同样剂量联合给药 ,肌肉注射 ,每 d一次 ,连续 1 0 d,同时设环磷酰胺阳性对照组和生理盐水阴性对照组 .基因治疗动物给药后第 1 5d处死 ,蛋白治疗组停药后第 2 d处死 ,观察疗效 ,计算抑瘤率 .结果显示 ,以上述方式给药 ,无论是基因治疗组还是重组蛋白组 ,给 PSP94的动物肿瘤虽然未见明显缩小 ,但肿瘤组织均出现不同程度的坏死和液化现象 ;给 TNFαD1 1 a的未见明显的抑瘤效果 ;PSP94-TNFαD1 1 a融合基因或 rh PSP94+ rh TNFαD1 1 a联合给药 ,不仅肿瘤有所缩小 ,而且也有不同程度的坏死和液化现象出现 .初步认为 :( 1 )

DnaJ类分子伴侣PBP的基因克隆及亚细胞定位研究

目的:从人骨骼肌cDNA文库中,分离、鉴定视网膜感光受体外周蛋白的结合蛋白(PBP)-DnaJ(HSP40)类分子伴侣,并初步分析其在转染的哺乳动物细胞中的表达及分布。方法:以33p-dCTP标记探针杂交筛选人骨骼肌cDNA文库,对阳性克隆进行序列分析,并以脂质体介导转染哺乳动物细胞,用免疫印迹及间接免疫荧光染色法检测目的蛋白的表达。结果:筛选出全长pbp基因,经与GenBank中的序列比较分析证实,与DnaJ家族的1个成员-mrj(1.5 kb)的序列相同,且含140 bp左右富含GC的非编码区上游序列。在COS-7细胞 中瞬时表达的PBP,大多呈典型的胞浆分布,而J-domain缺失的pbp片段多为胞核分布。而在CHO细胞中稳定表达的PBP,在处于不同细胞周期时相的细胞中的分布不同。结论:DnaJ除与HSP70(DnaK)协同发挥重要功能外,其本身作为分子伴侣也可能发挥着重要作用,且与细胞周期可能存在某种密切联系。

PCR快速检测临床标本中肺支原体的应用研究

肺炎支原体（ＭＰ）是引起呼吸道严重感染和造成地方性流行的常见传染病。该菌临床培养时间长，易受污染。我们用自行合成的引物，建立了ＰＣＲ直接检测临床标本中ＭＰ的方法，通过标本前处理，６８例病人标本ＰＣＲ直接检测的阳性率可达到３８．２％，并可在半天内报告结果，为人类原发性非典型肺炎的临床快速诊断提供了简便快速和特异敏感的检测手段，具有重要的临床应用价值。

人血小板生成素全长分子在酵母系统中的分泌表达及活性分析

外源基因可通过整合型载体被整合到毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）染色体上，获得遗传性稳定分泌表达株．利用酵母信号肽ＭＦα，对该信号肽蛋白酶识别位点的相关序列进行重新设计，使天然人ＴＰＯ成熟肽在毕赤酵母系统中分泌表达成功．表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ进行分析，分子量约为６６ｋＤ处蛋白条带可被ＴＰＯ抗体识别；表达量约为０．１ｇ／Ｌ；Ｎ端氨基酸序列分析结果与设计的一致；表达产物对小鼠骨髓细胞形成巨核细胞集落形成单位（ｍｅｇａｋａｒｙ－ｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ，ＣＦＵ－Ｍｅｇ）具有明显的刺激作用．

SAPGTP和PG为接头的5'IL6-TNFα衍生物融合蛋白

通过计算机模拟比较十种理论上柔性较好的接头在 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白中对 Ｉ Ｌ６ 和 Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构的影响情况，从中选择了 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ接头．以 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ 作为接头的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和以 Ｐ Ｇ 为接头的５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构预测结果相似． Ｄ Ｎ Ａ 序列分析两种蛋白的接头序列均与设计的一致．５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ蛋白的大肠杆菌表达产物经初步分离、纯化及鉴定后，生物学活性及对高表达 Ｉ Ｌ６ 受体肿瘤细胞的杀伤作用比较结果显示：在 Ｌ９２９细胞上，前者的生物学活性是后者的 ２７ 倍；在 Ｕ９３７ 细胞上，前者对肿瘤细胞的抑制率是后者的１３ 倍．它们对高表达 Ｉ Ｌ６ 受体的 Ｕ９３７ 细胞杀伤作用分别是同样突变位点的人 Ｔ Ｎ Ｆα衍生物的３７ 和 ２９ 倍．实验表明， Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白优于以 Ｐ Ｇ 作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白．

HRP直接标记属特异性基因探针检测沙门氏菌的研究

以活化辣根过氧化物酶复合物（ＨＲＰ—ＰＢＱ—ＰＥＩ＋—ＮＨ３＋）直接标记沙门氏菌属特异性ＤＮＡ探针ｐＬＳ２和ｐＬＳ３，探针与靶ＤＮＡ杂交后催化发光底物，经增强型化学发光反应（ＥＣＬ），用普通Ｘ光胶片自显影（ＣＰＤ）检测沙门氏菌。经狭缝杂交（Ｓｌｏｔｂｌｏｔ），该法标记探针均可检测到０．１ｐｇ的纯质粒ＤＮＡ及１０３个未经培养的鼠伤寒沙门氏菌。Ｄｏｔ—ｂｌｏｔ杂交结果证明，ＨＲＰ标记的探针仅与沙门氏菌属细菌杂交，而与试验的其他肠道非沙门氏菌不杂交。本研究表明，ＨＲＰ直接标记基因探针化学发光自显影法检测沙门氏菌，安全、快速、简便，且有高度的敏感性和特异性，是一种有较大应用前景的非放射性标记探针杂交检测方法。

原发性肝细胞性肝癌中p16基因的失活与P16蛋白表达的研究

作者分别采用多重PCR、SSCP以及以PCR为基础的甲基化分析法，对２５例原发性HCC标本及其相应的非肿瘤肝组织标本中p16基因的缺失、点突变及甲基化情况进行了检测。另用免疫组化SLAB法对３５例（包括前述已作基因检测的２５例）原发性HCC肿瘤标本及其相应的非肿瘤组织标本中P16蛋白的表达情况进行了检测。结果：２５例原发性HCC肿瘤标本中，３例有p16基因缺失，无p16基因缺失的２２例肿瘤标本中均未发现有p16基因点突变存在。肿瘤标本中基因的甲基化发生率为24%（6/25），而全部非肿瘤组织均未出现p16基因甲基化。在３５例HCC肿瘤标本中共发现P16蛋白表达缺失16例(45.7%)，而全部非瘤组织P16蛋白均表达阳性。由此提示，p16基因的失活与P16蛋白表达的丧失与原发性肝细胞性肝癌的发生及发展有关。

结核分枝杆菌Rv1009的生物信息学分析及克隆、表达

以往在对藤黄微球菌的研究中发现了促进复活因子(RPF),该因子可以有效促进休眠期的多种革兰氏阳性细菌复活和生长。生物信息学分析表明在多种革兰氏阳性细菌的基因组中均存在编码RPF样蛋白的基因。从GeneBank中获得了结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、谷氨酸棒杆菌和微链霉菌等革兰氏阳性细菌的多种RPF样蛋白相关信息,通过同源性分析发现这些蛋白均含有一个由75个氨基酸残基构成的高度保守序列,即RPF作用域。进一步对结核分枝杆菌H37Rv株的Rv1009进行了分析,并用PCR法克隆了其编码基因全长,定向克隆至pGEX 4T-2,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了Rv1009-GST融合蛋白的高效表达,为深入探讨其生物学功能奠定了基础。

结核分枝杆菌临床分离株耐药特点分析

目的 :分析临床分离结核分枝杆菌的耐药特点。方法 :用改良罗氏培养基间接药敏实验绝对浓度法检测结核菌的耐药情况。结果 :结核菌总耐药率 83.2 % ,耐多药率为 6 6 .4 %。其中初始耐药率 6 8.4 % ,初始耐多药率 36 .8% ,复治耐药率92 .4 % ,复治耐多药率 84 .7%。结论 :耐药及耐多药结核菌感染是临床治疗结核病的一个严重问题。临床分离结核杆菌耐药率和耐多药率高。分析临床分离株耐药特点 ,对控制结核病传染及指导临床合理用药具有重要意义。

脆弱拟杆菌DNA探针在临床上的应用

目的在 ＤＮＡ水平上准确鉴定 Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（脆弱拟杆菌）。方法用脆弱拟杆菌种特异的探针 ｐＢＦ－１５与分离株或标本进行ＤＮＡ点杂交。结果８株生化鉴定为脆弱拟杆菌的７株经ＤＮＡ探针证实为脆弱拟杆菌；１株粪拟杆菌、１株吉氏拟杆菌和２株未能鉴定到种的拟杆菌经探针重新鉴定为脆弱拟杆菌。用 ｐＢＦ－１５直接检测了 ４６例临床标本，其结果与常规法符合。结论 ＤＮＡ探针鉴定脆弱拟杆菌或诊断脆弱拟杆菌感染比常规法准确、快速、简便。

飞行员线粒体DNA高变区Ⅰ单核苷酸多态性研究

目的了解飞行员线粒体DNA高变区Ⅰ单核苷酸多态性(SNP)分布特点,探讨耐力相关的基因标记。方法以86例飞行员和80例健康对照人群为研究对象,用PCR产物直接测序的方法检测线粒体高变区ⅠSNPs,并与剑桥序列比对,确定SNPs的位点、类型及频率。结果飞行员和健康对照人群线粒体DNA高变区ⅠSNPs分布频率高于10%的位点分别有11个和8个,高于20%的位点分别有7个和5个,其中飞行员C16257A和C16261T位点频率明显高于健康对照组。结论线粒体DNA高变区ⅠSNPs位点C16257A和C16261T有可能与飞行员飞行耐力相关。

幽门螺杆菌PCR检测的研究进展

幽门螺杆菌是急性、慢性胃炎、和十二指肠溃疡的致病菌，并可能与胃癌有关，因此对该菌进行检测在临床上具有重要价值，本文仅就ＰＣＲ应用于该菌检测的标本处理，引物设计，扩增步骤、扩增产物的分析和ＰＣＲ诊断的临床意义等做简要介绍。

铜绿假单胞菌中Ambler A和D类酶流行状况与药物敏感性研究

目的了解Ambler A和D类β-内酰胺酶在铜绿假单胞菌(PA)的流行状况及其与药物敏感性的关系。方法用琼脂稀释法检测101株铜绿假单胞菌对8种常用抗菌药物的最低抑菌浓度,并PCR测序法鉴定101株铜绿假单胞菌中Ambler A和D类β-内酰胺酶流行状况。结果101株铜绿假单胞菌对8种常用药物的MIC50的范围为232μg/ml。最有效的药物是美罗培南,但也仅能抑制80·2%的菌株。1种或1种以上β-内酰胺酶基因阳性的有27株,其中tem-1型是最常见的亚型,共有14株菌阳性;有10株菌oxa-10基因阳性;菌株PA36的oxa-Ⅰ群酶基因在基因库中无完全同源序列,将其暂命名为oxa-56like,并已提交基因库,序列号为EF437948。结论铜绿假单胞菌对β-内酰胺类耐药现象非常普遍,产酶株有对广谱抗菌药物广泛耐药的趋势。因此,早期及时地检出产酶菌株对临床治疗中抗菌药物的选择和控制感染的播散都是非常重要的。

酵母系统表达TPO与E.coli表达TPO N端结构域生物半衰期比较

为了探讨血小板生成素（ＴＰＯ）糖基化与其生物半衰期的关系，首先纯化了巴氏毕赤酵母系统分泌表达的人ＴＰＯ成熟肽和大肠杆菌表达的人ＴＰＯＮ端结构域蛋白．纯化产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定和活性分析后，两种蛋白以相同浓度或相同活性单位给Ｗｉｓｔｅｒ大鼠尾静脉注射，利用酶联免疫分析（ＥＬＩＳＡ）和ＴＦ１细胞测定不同时间点实验动物血浆中ＴＰＯ浓度或生物学活性，求出两种ＴＰＯ的生物半衰期（ｔ１／２）值．结果显示，以相同浓度和相同活性单位给药，ＴＰＯ成熟肽的ｔ１／２均比其Ｎ端结构域的长，前者分别是后者的１．６５倍和１．２７倍．

Meis1在结直肠腺瘤癌中的表达及其临床意义

目的:探讨meis1在结直肠正常黏膜腺瘤癌发展过程中的表达变化及其临床意义。方法:应用荧光定量RT-PCR及免疫组化检测meis1在结直肠腺瘤癌中的表达及其临床意义。结果:RT-PCR结果显示meis1在正常肠黏膜中有一定程度的表达,随着腺瘤癌的发展表达下调。免疫组化结果显示,在正常肠黏膜、腺瘤及癌中meis1的表达率分别为92.9%、87.5%及63.1%,腺癌与正常、腺瘤相比差异有显著性(P<0.05)。meis1表达部位随着正常黏膜向腺瘤癌发展过程中出现典型的胞核至胞浆异位,且异位与患者淋巴结转移相关(P<0.05)。结论:Meis1的表达下调及胞浆异位与结直肠癌的发生及进展相关。

阵发性睡眠性血红蛋白尿症发病机制研究动向

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmalnocturnal hemoglobinuria,PNH)发生机制一直是血液学、免疫学、生物化学家都有兴趣的研究课题,但百余年中仅近十年才有一些较重要的发现,对今后工作有所启示。

飞行员中CKB基因rs3759582和rs3759584位点多态性研究

目的了解飞行员脑型肌酸激酶(CKB)基因rs3759582和rs3759584位点多态性情况,探讨其与飞行员基础正加速度(+Gz)耐力的可能关系。方法用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)对122名飞行员和128名普通健康人CKB基因rs3759582和rs3759584位点进行多态性分析比较。结果 rs3759582位点基因型和等位基因频率在两组间无统计学差异(P>0.05),rs.3759584位点基因型和等位基因频率在两组间有显著统计学差异(P<0.01),TT基因型和T等位基因在飞行员组明显高于普通对照组。结论 CKB基因rs3759582位点不是预测飞行员飞行时+Gz耐力的基因标记,rs3759584位点T等位基因对飞行员飞行时+Gz耐力可能有重要作用。

血小板生成素cDNA体内转送促进血小板生成的研究

血小板生成素(TPO)是巨核-血小板系分化和生长的特异调控因子,在临床骨髓抑制症的治疗中有很大的应用价值。重组多肽细胞因子一般因难以避免的污染,体内半衰期短等因素,造成其生物活性不能有效发挥或产生毒副作用。若相关基因经适当途径转送后在体内表达,可克服此类不良因素,同时为研究细胞因子对机体长期作用提供了比较理想的模型。我们曾观察到把hTPO cDNA通过质粒载体转送到小鼠体内后,使小鼠对环磷酰胺的毒性作用产生明显的耐受。