牛蒡子苷元对小鼠和大鼠抗肿瘤免疫增强作用研究

目的肿瘤免疫干预活性药物的筛选尚无功能评价方法,探索使用SD大鼠和ICR小鼠建立对人源瘤株抗肿瘤免疫的评价方法,考察牛蒡子苷元对机体抗肿瘤免疫增强作用。方法大鼠皮下注射给予牛蒡子苷元,同时用人源肿瘤细胞对大鼠免疫,分离大鼠白细胞、血清并与人源肿瘤细胞共培养,检测培养上清液中乳酸脱氢酶(lactate de hydrogenase,LDH)的含量,考察大鼠白细胞与免疫血清对人源瘤株的杀伤力;应用冻融法制备H22细胞裂解物H22TCL。ICR小鼠给药第1、4和7天H22TCL腹腔免疫,第11天小鼠停药并接种H22细胞于腋下,观察肿瘤的发生率,验证牛蒡子苷元抗肿瘤免疫增强作用。结果牛蒡子苷元能够增强SD大鼠白细胞、血清与人源肿瘤细胞体外共培养上清液中LDH含量;牛蒡子苷元能够显著降低ICR小鼠肿瘤的发生率。结论本研究建立使用SD大鼠的免疫血清、白细胞与肿瘤细胞共培养,检测上清中LDH含量筛选抗肿瘤免疫药物的方法,并且牛蒡子苷元降低了小鼠肿瘤的发生率,从而证实了牛蒡子苷元影响了机体的免疫系统,提高动物的抗肿瘤免疫能力,牛蒡子苷元能够提高机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用,提高机体抗肿瘤免疫力。

基于网络药理学和实验验证探讨荆防颗粒对自身免疫性肝炎小鼠的治疗作用及作用机制

目的基于网络药理学及动物实验探讨荆防颗粒对自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)小鼠的治疗作用及作用机制。方法通过TCMSP数据库筛选荆防颗粒的活性成分及其对应的靶点,通过检索Omim、Drugbank和GeneCards数据库收集AIH相关的靶点,进而得到荆防颗粒治疗AIH的关键靶点;将获得的关键靶点导入STRING数据库进行分析,并构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,通过Cytoscape软件可视化;通过Metascape数据库对关键靶点进行基因本体(gene ontology,GO)功能及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。通过建立刀豆蛋白A诱导的AIH小鼠模型探讨荆防颗粒治疗AIH的作用机制。结果共筛选得到荆防颗粒中159个潜在活性成分和269个相关的靶点,与343个AIH相关靶点取交集,获得25个交集靶点。PPI网络分析显示,白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β、信号传导和转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)和IL-8/CXC型趋化因子配体8(CXC chemokine ligand 8,CXCL8)等靶点可能为荆防颗粒治疗AIH的关键靶点;KEGG通路富集分析得到炎症途径和凋亡相关途径信号通路。体内实验结果显示,与模型组比较,荆防颗粒显著减轻了刀豆蛋白A诱导的肝炎,表现为小鼠存活率增加、肝细胞坏死减少、血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)活性降低(P<0.05、0.01);荆防颗粒还通过抑制IL-6/STAT3、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)/IL-1β和TNF-α/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路进而调节多种细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、CXCL-8)的产生(P<0.05、0.01),从而发挥抗炎、抗凋亡作用。结论荆防颗粒通过多成分、多靶点发挥治疗AIH的作用。

牛蒡子苷元皮下注射对Beagle犬重复给药毒性研究

目的观察连续皮下注射牛蒡子苷元(NBZGY)对Beagle犬产生的毒性反应,为临床用药安全提供参考。方法普通级Beagle犬40只,雌雄各半,分为5组:对照组、聚乙二醇(PEG)对照组及NBZGY 6、20、60 mg·kg^(-1)组,每组8只。各组犬按1.2 m L·kg^(-1)的给药体积经皮下注射给药,每天1次,连续给药28天,停药后观察2周。实验期间对动物的一般状况、摄食量、体重、血液学、血液生化等指标进行了检测和检查。结果 PEG对照组及NBZGY各剂量组犬给药部位可见与PEG相关的刺激性反应,60 mg·kg^(-1)可增强该刺激性,停药后给药部位刺激性可见部分恢复。给药期间,20、60 mg·kg^(-1)导致犬出现肝损伤和胆管损伤。恢复期结束,20 mg·kg^(-1)组犬肝胆损害恢复正常,60 mg·kg^(-1)组犬肝胆损伤未见明显恢复。除注射部位刺激性外,6 mg·kg^(-1)组未见其他明显毒性。结论 Beagle犬连续皮下注射大剂量的NBZGY,可增强Beagle犬对PEG相关刺激的反应,并引起犬的肝胆损伤。

荆防颗粒浸膏幼龄大鼠28天重复灌胃给药毒性研究

目的探讨连续28 d重复灌胃荆防颗粒浸膏对刚离乳SD大鼠出现的毒性反应,为荆防颗粒浸膏在儿童患者中的应用提供参考。方法选用刚离乳SD大鼠144只,按照体重随机分为荆防颗粒浸膏1、3、10 g·kg^(-1)·d^(-1)3个剂量组和空白对照组(注射用水0 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组36只,雌雄各半。动物按照15 mL·kg-1的给药体积分别灌胃相应浓度的荆防颗粒浸膏和注射用水,每日1次,连续灌胃28 d,停药恢复28 d。试验期间,每日观察动物一般状态,每周2次检测动物体重和摄食量,雄鼠检查包皮分离时间、睾丸精子数量、血清睾酮,雌鼠检查阴道张开时间、动情周期和血清雌激素;给药期结束和恢复期结束分别对动物骨骼发育、神经系统功能、学习记忆、生长激素水平、免疫球蛋白水平、眼科学、血液学、血液生化学、尿液学和组织病理学进行检查。结果荆防颗粒浸膏各剂量组未见与受试物相关的异常体征,体重和摄食量无显著改变。10 g·kg^(-1)·d^(-1)组血液学指标白细胞(WBC)、中心粒细胞(NEUT)、淋巴细胞(LYMPH)、单核细胞(MONO)和血液生化学指标总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、白蛋白(ALB)略有改变;且镜下观察脾脏可见“星空”现象。结论幼龄大鼠连续28 d灌胃荆防颗粒浸膏,未引起动物一般体征、体重、摄食量、性发育和性激素水平、生长发育等指标的异常改变,血液学及血生化学指标与组织病理学略有改变,但认为与受试物的毒性作用不相关。

荆防颗粒浸膏大鼠90天重复灌胃给药毒性研究

目的观察SD大鼠灌胃给予荆防颗粒浸膏的重复给药毒性,指导荆防颗粒临床安全合理用药。方法选用SPF级大鼠144只,随机分为4组,即空白对照组(注射用水0 g·kg^(-1)·d^(-1)),荆防颗粒浸膏1、3、10 g·kg^(-1)·d^(-1)剂量组,每组36只,雌雄各半。每日灌胃给药1次,连续给药90 d,停药后恢复观察30 d。检测指标包括一般观察、摄食、体重、眼科及尿液检查、血液学检查、生化学检查、主要脏器称量和脏器系数计算、组织病理学检查。结果SD大鼠按照1、3、10 g·kg^(-1)·d^(-1)剂量重复灌胃荆防颗粒浸膏90 d后,1、3 g·kg^(-1)·d^(-1)剂量组未引起动物的一般状态、摄食量、体重、血液学、血液生化学和组织病理学的异常改变;10 g·kg^(-1)·d^(-1)剂量组雄鼠摄食量降低,体重增长缓慢,组织病理学检查可见大鼠早期慢性进行性肾病发生率升高,上述效应在恢复期结束后均恢复正常。结论SD大鼠90 d重复灌胃荆防颗粒浸膏的无明显毒副反应剂量(NOAEL)为3 g·kg^(-1)·d^(-1),有毒剂量为10 g·kg^(-1)·d^(-1),该剂量下荆防颗粒浸膏引起动物食欲减退及慢性进展性肾炎(CPN)发生率提高,考虑到人没有与CPN相对应的疾病,由此谨慎地推断最严重的情况下该剂量荆防颗粒浸膏会存在潜在的轻微肾损伤。上述效应在恢复期结束后均恢复,表明荆防颗粒浸膏导致的不良反应具有可逆性。

荆防颗粒浸膏对大鼠胚胎-胎仔发育毒性研究

目的探讨荆防颗粒浸膏对动物胚胎-胎仔发育的影响,为其药用价值的进一步开发提供参考。方法112只受精雌鼠分为空白对照组和荆防颗粒浸膏高、中、低剂量(10、3、1 g·kg^(-1)·d^(-1))组,每组28只。全部动物于妊娠第6天(GD6)开始给药,每天灌胃给药1次,连续给药至GD15,停药至GD20解剖检查。试验期间,每天观察动物一般状态,定期检测动物体质量和摄食量,解剖时计数卵巢黄体数量、检查着床数和活胎数,测量活胎顶臀长和尾长,检查活胎外观、内脏和骨骼。结果给药期间,动物未见异常体征变化;与空白对照组比较,荆防颗粒浸膏未引起大鼠体质量异常增长;母本动物受孕率、平均黄体数量和受精卵着床丢失率也未见异常改变;窝均活胎率、死胎率和吸收胎率,胎仔顶臀长和尾长也未见明显改变;未见受试物导致胎仔外观、内脏和骨骼畸形。结论荆防颗粒浸膏未见潜在的大鼠胚胎-胎仔发育毒性,无明显损害作用剂量(NOAEL)为10 g·kg^(-1)·d^(-1)。

荆防颗粒浸膏对大鼠生育力与早期胚胎发育毒性研究

目的观察荆防颗粒浸膏对SD大鼠生育力及早期胚胎发育的影响,为其药用价值的进一步开发提供参考。方法选用SPF级大鼠168只,随机分为4组,即空白对照组,荆防颗粒浸膏1、3、10 g·kg^(-1)·d^(-1)剂量组,每组42只,雌雄各半。全部动物灌胃给予对应药物,每日1次,给药体积15 mL·kg^(-1)。雌雄大鼠分别给药2周和4周后按照1∶1合笼交配。动物交配期间持续给药,交配成功雌鼠继续给药至妊娠第6天,交配成功雄鼠持续给药直至处死。试验期间检测指标包括一般观察,摄食,体重,雄鼠精子活动度、数量和形态,妊娠雌鼠妊娠情况和着床腺数(活胎、死胎、吸收胎),主要脏器称量和脏器系数计算。结果试验期间,空白对照组及荆防颗粒浸膏1、3、10 g·kg^(-1)·d^(-1)剂量组动物均未见受试物引起的异常体征。与空白对照组比较,荆防颗粒浸膏1、3、10 g·kg^(-1)·d^(-1)剂量组雌、雄大鼠交配前体重、雌鼠妊娠期体重和体重增重以及雌、雄鼠交配前摄食量、雌鼠妊娠期摄食量均未见显著改变;动物交配天数、交配率和雌鼠受孕率、雄鼠精子质量和雌鼠妊娠结局均未见异常改变。结论本实验条件下,荆防颗粒浸膏未见潜在的大鼠生育力与早期胚胎发育毒性,无明显损害作用剂量(NOAEL)为10 g·kg^(-1)·d^(-1)。

荆防颗粒浸膏大鼠灌胃给药围产期发育毒性研究

目的检测自胚胎着床到幼仔离乳给予荆防颗粒浸膏,评价其对妊娠及哺乳雌性大鼠及F1代大鼠和F2代大鼠生长发育的影响,为其临床安全应用提供依据。方法妊娠大鼠96只,随机分为空白对照组和荆防颗粒浸膏低剂量组(1 g·kg^(-1)·d^(-1))、中剂量组(3 g·kg^(-1)·d^(-1))、高剂量组(10 g·kg^(-1)·d^(-1))。各组妊娠大鼠于妊娠6 d至离乳,每日给予雌性大鼠不同剂量的荆防颗粒浸膏。观察F0代妊娠大鼠体质量、摄食量、分娩情况和泌乳情况。F1代大鼠及F2代大鼠分娩后观察出生仔鼠的外观、体质量、生长发育指标、神经反射指标、行为学指标等。结果荆防颗粒浸膏10 g·kg^(-1)·d^(-1)及以下剂量无母体毒性;对F1代大鼠和F2代哺乳期新生仔鼠无毒性;F1代和F2代大鼠的体质量增长及摄食、生长发育、神经反射及学习记忆功能与空白组比较无显著性差异(P>0.05),不影响F1代大鼠脏器发育及生殖功能。结论在本实验条件下,荆防颗粒浸膏对SD大鼠围产期发育的无毒性反应剂量(NOAEL)为10 g·kg^(-1)·d^(-1)。

荆防颗粒对糖尿病小鼠视网膜的保护作用

目的探讨荆防颗粒对db/db小鼠血糖代谢的调控作用及对其视网膜病变(diabetic retinopaphy,DR)的保护作用。方法将60只雄性db/db小鼠随机分为模型组、二甲双胍(120 mg/kg)组及荆防颗粒(1、2 g/kg)组,每组15只,另取15只雄性db/m小鼠作为对照组,每周检测小鼠体质量、空腹血糖、摄食量及饮水量等基础指标,并在实验结束后进行口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT);采用ELISA检测小鼠视网膜组织白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平和过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性;采用PAS染色检测视网膜组织病理变化;采用Western blotting检测视网膜组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、紧密连接跨膜蛋白(Claudin-1)、胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)、磷酸化IRS1(phosphorylated IRS1,p-IRS1)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化PI3K(phosphorylated PI3K,p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(phosphorylated Akt,p-Akt)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved cystein-asparate protease-3,cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果与对照组比较,模型组小鼠空腹血糖、摄食量、饮水量明显升高(P<0.01),OGTT中曲线下面积(AUC)显著升高(P<0.01);视网膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α和MDA含量显著升高(P<0.01),CAT、SOD活性显著下降(P<0.01);视网膜组织周细胞降低,新生血管增多(P<0.01),并且视网膜组织中Claudin-1、p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2蛋白表达下调(P<0.01),VEGF、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达上调(P<0.01)。与模型组比较,荆防颗粒组小鼠体质量明显升高(P<0.05、0.01),空腹血糖、摄食量、饮水量均有不同程度下降(P<0.05、0.01);视网膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA含量显著下降(P<0.05、0.01),CAT、SOD活性显著上升(P<0.05、0.01);视网膜组织病理形态有所改善,视网膜组织中Claudin-1、p-IRS1/IRS1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2蛋白表达显著上调(P<0.05、0.01),VEGF、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达显著下调(P<0.05、0.01)。结论荆防颗粒对db/db小鼠视网膜病变具有一定的改善作用,其作用机制可能为调节小鼠视网膜组织中VEGF及Claudin-1蛋白表达,进而激活胰岛素受体IRS-1/PI3K/Akt信号通路,启动Caspase级联反应,抑制视网膜上皮细胞的凋亡,从而对视网膜病变起到一定的保护作用。

榆栀止血颗粒干预多囊卵巢综合征大鼠的机制研究

探讨榆栀止血颗粒对多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)模型大鼠的治疗作用并运用代谢组学技术探究其作用机制。将大鼠随机分为正常组,模型组,榆栀止血颗粒低、中、高(0.5、1.5、4.5 g·kg^(-1)·d^(-1))剂量组,阳性药组(二甲双胍0.2 g·kg^(-1)·d^(-1))。除正常组外,其余各组灌胃1 mg·kg^(-1)·d^(-1)来曲唑并饲喂高糖高脂饲料,连续造模40 d后,模型组继续灌胃来曲唑和蒸馏水,给药组灌胃来曲唑和不同剂量榆栀止血颗粒,阳性药组灌胃来曲唑和二甲双胍,正常组灌胃同等体积蒸馏水,每日1次,连续50 d。采用血糖仪检测口服糖耐量;酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠血清胰岛素水平;放射免疫法检测大鼠血清中卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(estradiol,E_(2))和睾酮(testosterone,T)水平;全自动生化分析仪检测血清中高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、甘油三酯(triglyceride,TG)水平;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察大鼠卵巢组织病理改变;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测大鼠卵巢组织中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinases,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)蛋白及其磷酸化水平;超高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测PCOS大鼠粪便及血清代谢产物。结果表明,与模型组相比,给药组大鼠糖耐量受损改善,胰岛素敏感性增强;血清HDL-C、E_(2)水平升高,TG、T水平下降;卵巢组织病理多囊样状态改善;卵巢组织p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平升高;粪便代谢筛选出46个差异代谢物和10条代谢通路,主要涉及不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢等;血清代谢筛选出34个差异代谢物和15条代谢通路,主要涉及不饱和脂肪酸的生物合成、氨酰基tRNA生物合成等。综上所述,榆栀止血颗粒可改善PCOS糖脂、性激素紊乱,调节卵巢状态,其机制可能与影响粪便及血清代谢,激活PI3K/Akt通路有关。

基于ERK/p38 MAPK信号通路探讨荆防颗粒对角叉菜胶所致小鼠尾部血栓的作用研究

研究荆防颗粒对角叉菜胶所致小鼠尾部血栓的抗炎、抗血栓作用机制。32只雄性ICR小鼠随机分为正常组、模型组、荆防颗粒给药组、阿司匹林阳性药组,每组8只。腹腔注射角叉菜胶(45 mg·kg^(-1))+低温处理进行血栓模型的制备,于造模前给药7 d。造模后24 h取血检测各组小鼠凝血四项;ELISA试剂盒检测血浆中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子活性变化;剪取各组小鼠尾部,观察尾部病变程度并测量血栓长度;利用Western blot检测脾脏组织细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)蛋白表达及磷酸化水平。结果显示,各组小鼠尾部均出现不同程度的暗红色血栓,模型组黑尾长度约占总尾长的40%,凝血酶原时间(PT)显著延长、纤维蛋白原(FIB)含量显著升高、活化部分凝血活酶时间(APTT)明显缩短;与模型组比较,给药组黑尾长度明显缩短;凝血四项有明显改善(P<0.05)。ELISA试剂盒检测表明,模型组小鼠血浆中TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量显著升高;与模型组比较,给药组小鼠血浆中TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量明显减少(P<0.05)。Western blot检测结果显示,模型组小鼠脾脏组织中ERK1/2、p38 MAPK蛋白表达及其磷酸化水平明显上调;与模型组相比,给药组ERK1/2、p38 MAPK蛋白表达及其磷酸化水平均有显著下调,差异有统计学意义。荆防颗粒能够缩短角叉菜胶所致小鼠尾部血栓形成,其机制可能与抑制ERK1/2、p38 MAPK信号通路激活相关。

首荟通便胶囊对慢性传输性便秘小鼠肠道屏障的影响

目的研究首荟通便胶囊对慢性传输性便秘小鼠肠道屏障的影响。方法48只ICR小鼠随机分成对照组、模型组和首荟通便胶囊(300 mg/kg)组,小鼠ig复方地芬诺酯(10 mg/kg)建立便秘模型,同时给予药物进行干预。实验结束后,检测小鼠肠蠕动和排便功能,采用ELISA法检测小鼠血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和D-乳酸水平;采用苏木素-伊红(HE)染色法考察小鼠结肠组织病理变化;采用Western blotting检测小鼠结肠组织紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)、Occludin、Claudin 5、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)、MMP-2和金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的蛋白表达情况。结果与对照组相比,模型组小鼠排便功能和肠蠕动功能降低(P<0.05、0.01),肠道炎性细胞浸润明显;血清中D-乳酸和TNF-α水平显著升高(P<0.05、0.01);结肠组织Claudin 5、Occludin、ZO-1和TIMP-1蛋白表达水平降低(P<0.05、0.01),MMP-2和MMP-9蛋白表达水平升高(P<0.05)。与模型组相比,首荟通便胶囊组小鼠排便功能和肠蠕动功能增强(P<0.05、0.01),肠道炎性细胞浸润减少;血清中D-乳酸和TNF-α水平降低(P<0.05);结肠组织Claudin 5、Occludin、ZO-1和TIMP-1蛋白表达水平升高(P<0.05、0.01),MMP-2和MMP-9蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论首荟通便胶囊能够治疗小鼠便秘,其机制可能与降低便秘小鼠肠道炎症和通透性、调节肠道屏障相关蛋白的表达以及保护肠道屏障有关。