UPLC-MS/MS法检测大鼠血浆中阿法替尼浓度及其药动学研究

目的:建立一种检测大鼠血浆中阿法替尼浓度的UPLC-MS/MS方法。方法:选择用乙腈沉淀的蛋白质样品进行样品处理并运用Waters XEVO TQD三重四级杆液质联用仪和CORTECS BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.6μm)分离分析物。流动相由乙腈和水(0.1%甲酸)组成,流速为0.4 ml·min^(-1),柱温为40℃,内标为来那替尼。采用正离子电喷雾多反应监测(MRM)模式对分析物进行定量,目标碎片离子为阿法替尼m/z 486.19→112.1,来那替尼(IS)m/z 557.3→112.15。结果:阿法替尼在1-200 ng·ml^(-1)范围内线性关系良好(r=0.998 1),定量下限为1 ng·ml^(-1)。日内精密度和日间精密度均≤9.51%,阿法替尼从血浆中回收率高于77.1%。大鼠灌胃给药和静脉给药阿法替尼后,t_(1/2)分别为7.19 h和2.69 h,C_(max)分别为97.78 ng·ml^(-1)和123.37 ng·ml^(-1),AUC_((0-∞))分别为1 505.4 ng·h·ml^(-1)和405.55 ng·h·ml^(-1)。结论:该方法准确可靠,操作简便,重复性好,适用于灌胃和静脉注射10和2 mg·kg^(-1)剂量的阿法替尼的药动学研究。

中国汉族人群24种CYP2C19新突变体的体外活性研究

目的以S-美芬妥英为探针药,体外分析24种汉族人群CYP2C19新变异体的酶学活性。方法以野生型CYP2C19 c DNA为模板,通过定点诱变方法获得24种CYP2C19新变异体和典型变异体CYP2C19.3的c DNA,利用Bac-toBac Baculovirus Expression System试剂盒,获得高表达各型CYP2C19变异体的昆虫微粒体。Western blot法进行CYP2C19蛋白定量。以S-美芬妥英为探针底物药,体外测定不同药物浓度下各型CYP2C19变异体的最大反应速率Vmax和米氏常数Km,评价新突变类型对CYP2C19体外代谢活性的影响。结果利用昆虫表达系统,成功获得高表达典型变异体CYP2C19.3和24种CYP2C19新变异体的昆虫微粒体。Western blot结果显示,变异体CYP2C19.3和35FS无正常CYP2C19酶的表达,与野生型相比,变异体CYP2C19.29和T130M表达量明显下降,其余变异体蛋白表达量与野生型接近。体外代谢实验结果显示,变异体L16F针对S-美芬妥英的体外清除率(Vmax/Km)较野生型升高,T130M的活性与野生型相似,其余各突变型的清除率均低于野生型。其中,突变体CYP2C19.3、35FS和R124Q对于该底物药无代谢活性。结论新发现的24种CYP2C19基因变异大多可引起酶体外药代活性显著降低,提示携带此类基因突变的个体服用经由CYP2C19代谢药物时,体内药物代谢速度可能会显著变慢,临床用药时需密切关注。

CYP2C9*58型新突变体的体外酶学活性研究

目的对CYP2C9基因新突变体(CYP2C9*58型)开展体外酶学功能研究,明确其代谢活性与野生型的相关性。方法以CYP2C9基因cDNA为模板,通过定点诱变方法获得CYP2C9各变异体的cDNA全长,用以构建昆虫表达载体。利用杆状病毒包装试剂盒包装昆虫病毒,侵染sf21昆虫细胞后获得高效表达CYP2C9各型蛋白的微粒体。以甲苯磺丁脲为探针底物药,利用获得的微粒体体外测定各变异体的最大反应速率V max和米氏常数K m,评价其主要酶促动力学特性。结果成功构建了CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3和CYP2C9*58型4种CYP2C9昆虫表达载体,Western blot证实该载体可用于稳定表达相应的CYP2C9突变体。CYP2C9*2、CYP2C9*3和CYP2C9*58型变异体的体外酶学活性分别为野生型CYP2C9*1的91.6%,13.5%和23.1%。结论 CYP2C9*58型的酶学活性较野生型明显降低,接近于典型缺陷型突变体CYP2C9*3型,提示携带此突变型的患者在服用经由CYP2C9代谢的相关药物时,药物代谢速度较野生型携带者会有一定程度的降低。

大鼠体内外细胞色素P450酶活性检测方法的建立及应用

目的建立快速、简便、灵敏可以同时测定大鼠体内外“鸡尾酒”探针药物和代谢产物的LC-MS/MS方法,并用于大鼠肝微粒体外代谢和大鼠体内的药代动力学研究。方法所有样品均加入乙腈进行沉淀处理,然后在UPLC CORTECS C18(2.1 mm×50 mm,1.6μm)色谱柱分离,质谱方法采用多反应监测模式(MRM)。液相方法采用梯度洗脱流动相乙腈-0.1%甲酸水。结果6种探针药和代谢产物的体内外样品方法学验证符合生物样品检测要求。该方法成功应用于大鼠体内外“鸡尾酒”实验中。结论本实验建立的“鸡尾酒”方法可用于体内外快速评价药物或中草药对相应的CYP450亚型酶活性的影响,可以用于潜在的药物相互作用的预测。

独一味胶囊中2种成分的同时测定及在大鼠血浆中的药动学特征

目的建立超高效液相串联质谱（UPLC-MS/MS）法同时测定独一味胶囊（独一味）中胡麻属苷和类叶升麻苷,并研究其在大鼠血浆中的药代动力学特征。方法蛋白沉淀法处理血浆后,采用Acquity UPLC BEH C（18）色谱柱（50 mm×2.1 mm,1.7μm）分析;流动相为乙腈-0.1%甲酸水,梯度洗脱;体积流量为0.4 m L/min。结果类叶升麻苷的线性范围为1～250 ng/m L（r=0.998 9）,最低定量限为0.2 ng/m L;胡麻属苷的线性范围为0.5～100 ng/m L（r=0.998 6）,最低定量限为0.1 ng/m L;低、中、高质量浓度的日内、日间精密度RSD均〈8.84%,类叶升麻苷的相对回收率分别为（105.33±8.64）%、（101.55±1.22）%和（96.89±5.42）%,而胡麻属苷分别为（103.89±9.18）%、（99.34±6.63）%和（95.88±3.69）%。大鼠静脉注射胡麻属苷和类叶升麻苷后,两者的t（1/2）分别为（1.45±0.28）h和（0.7±0.25）h,AUC（0-t）分别为（128.79±30.52）ng/（h·m L）和（98.39±16.52）ng/（h·m L）。结论该方法简便、快捷,灵敏,适用于这两种成分的药代动力学研究。

超高效液相串联质谱法快速测定CYP2C9酶活性

目的：建立一种超高效液相串联三重四级杆质谱法快速测定CYP2C9体外酶学活性检测的新方法。方法：色谱柱为ACQUITY UPLCBEH C18柱（100 mm×2.1 mm,1.7μm）;流动相为乙腈-水（含0.1%甲酸和0.5%氨水）（40∶60）,流速为0.2 ml·min^-1,柱温30℃,内标为氯磺丙脲;质谱条件：电喷雾离子化源（ESI）,正离子检测模式;用实验室制备的CYP2C9＊1,＊2,＊3和＊13酶在37℃孵育甲苯磺丁脲后,加入800μl冰乙酸乙酯终止反应,10 000 g离心后取有机层于氮吹仪下吹干并用200μl流动相复溶后上样。结果：4-羟基甲苯磺丁脲的保留时间为1.21 min,线性范围为0.05-5 ng·μ^l-1（r=0.999 8）,最低定量限为0.01 ng·μl^-1,回收率为99.3%-100.3%。4-羟基甲苯磺丁脲的日内、日间RSD均〈5%,孵育体系中的其他内源性物质不干扰测定。CYP2C9＊1,＊2,＊3和＊13孵育甲苯磺丁脲后结果显示突变体CYP2C9＊2,＊3,＊13的体外酶学活性分别为野生型CYP2C9＊1的47.3%,11%和0.3%。结论：该方法快速、稳定,该方法操作简便,适于CYP2C9的快速活性检测及抑制药等的相关性研究。

木犀草素和木犀草苷在大鼠体内的药动学研究

目的：建立测定木犀草素和木犀草苷在大鼠体内的药动学方法并测定其药动学参数。方法：16只SD大鼠随机分为木犀草素组（舌下iv,1.34mg/kg）和木犀草苷组（舌下iv,0.64mg/kg）,并于给药前和给药后0、15、30min及1、2、3、4、6、8、12、24、48 h经尾静脉取血0.5 ml制备血浆,采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法测定血药浓度,并计算药动学参数。色谱柱为CORTECSTM UPLC-C（18）（100 mm×2.1 mm,1.6μm）,流动相为乙腈-水（含0.1%甲酸）,流速为0.4 ml/min,柱温为40℃,内标为槲皮苷。结果：木犀草素、木犀草苷的线性范围分别为2.5-500 ng/ml（r=0.998 2）、10-2 500 ng/ml（r=0.993 5）,定量下限分别为1、2.5 ng/ml,提取回收率分别为70.75%-87.72%、75.40%-91.18%（n=6）,日内、日间RSD均小于10%（n=3）。药动学参数t（1/2）分别为（1.88±0.32）、（1.57±0.08）h,CL分别为（0.77±0.18）、（0.06±0.01）L/（h·kg）,AUC（0-6h）分别为（189.60±40.04）、（1 093.14±187.36）ng·h/ml,AUC（0-∞）分别为（195.18±38.37）、（1 097.11±188.07）ng·h/ml。结论：本研究建立的方法可用于木犀草素和木犀草苷在大鼠体内的药动学研究,两者在大鼠体内的药动学符合二室模型。

超高效液相串联质谱法检测人血浆中华法林及其代谢产物的浓度

目的：建立快速检测人血浆中华法林及其代谢产物7-羟基华法林浓度的UPLC-MS/MS方法。方法：用乙腈沉淀血浆蛋白的方法处理,运用Waters XEVO TQD三重四级杆液质联用仪,色谱柱为ACQUITY UPLCBEH C18柱（50 mm×2.1mm,1.7μm）;流动相为乙腈-水（含0.1%甲酸）,梯度洗脱,流速为0.4 ml·min-1,柱温为40℃,内标为华法林-d5;质谱条件：电喷雾离子化源（ESI）,正离子检测模式。结果：华法林和代谢产物7-羟基华法林的保留时间分别为1.8 min和1.5 min,线性范围分别为25～2 000 ng·ml-1（r=0.999 3）和5～500 ng·ml-1（r=0.999 6）,最低定量限分别为5,2.5 ng·ml-1,回收率分别为96.9%～105.3%,97.1%～103.3%,日内、日间RSD均〈10%。结论：该法准确可靠,操作简便,重复性好,适于检测人血浆中华法林及其代谢产物7-羟基华法林的浓度。

影响人工全膝关节置换皮肤切口愈合因素研究进展

探讨人工全膝关节置换后皮肤切口愈合的影响因素。人工全膝关节置换切口愈合不良是术后常见并发症之一,其常影响到患者术后恢复和手术疗效。其主要与患者自身状况、医师术前准备、术中操作、术后管理等密切相关。目前对人工全膝关节置换后皮肤切口愈合因素研究较多,但所得结果不尽一致。其主要与类风湿性关节炎、糖尿病、营养不良、肥胖、缝合方式、引流管、止血带使用时间、手术入路等有关,这些因素不同程度地影响人工关节置换术后皮肤切口的愈合。

慢性肾功能衰竭肌肉蛋白降解的分子机制

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure,CRF)患者普遍存在以肌肉萎缩、体重下降为特征的营养不良状态,严重影响患者生存质量。研究表明其主要原因为肌肉蛋白降解增加,最终导致低蛋白血症甚至恶液质而影响预后,然而对于这种蛋白降解的分子机制目前仍不十分明确。现将近年来国内外有关文献进行归纳总结,为今后CRF营养不良的临床诊断、治疗提供基础。

参麦注射液对大鼠细胞色素P450酶亚型活性的影响

目的用Cocktail探针药物法研究参麦注射液对大鼠细胞色素P450酶（CYP450）6种亚型活性的影响。方法将SD大鼠随机分组,实验组ip给予参麦注射液（10 m L/kg）,对照组ip给予等量生理盐水,诱导7 d,分别以非那西丁、安非他酮、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、美托洛尔和咪达唑仑作为CYP1A2、CYP2B1、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的探针药物。UPLC-MS/MS法检测大鼠血浆中探针药物的血药浓度,采用DAS3.0软件估算药动学参数。结果与对照组相比,非那西丁、安非他酮和奥美拉唑的AUC0^∞、CL和Cmax显著降低（P〈0.05）,甲苯磺丁脲、美托洛尔和咪达唑仑的AUC0^∞、CL和Cmax无显著性差异。结论参麦注射液对大鼠CYP1A2、CYP2B1和CYP2C19亚型的活性有明显的抑制作用,而对CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4亚型的活性无显著性影响。

超高效液相串联质谱法测定大鼠西酞普兰及其代谢物的血药浓度

目的建立快速测定大鼠体内西酞普兰及其代谢物（N-氧化西酞普兰和N-去甲基西酞普兰）浓度的超高效液相串联质谱法。方法用乙酸乙酯萃取法处理血浆,色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm,1.7μm）;流动相为乙腈-0.1%甲酸水,梯度洗脱,流速为0.4 mL·min^-1;用正离子多离子反应监测（MRM）扫描,内标为曲马多。结果血浆中西酞普兰、N-去甲基西酞普兰和N-氧化西酞普兰的线性范围分别为0.1～10.0,0.1～10.0,0.01～2.00 ng·mL^-1（r=0.999 1,0.999,0.999 6）,定量下限分别为0.05,0.05,0.01ng·mL^-1。其回收率分别在96.09%～105.33%。三者的日内、日间精密度均RSD〈8.69%。结论该方法操作简便、快捷,灵敏度高,适于大鼠体内西酞普兰及其代谢物的药代动力学研究。

细胞色素P450 2C9新突变1400T＞C的发现及体外酶活性研究

目的 明确1例华法林高敏感患者细胞色素P450 2C9酶（CYP2 C9）的新突变及其生物学功能.方法 提取患者基因组DNA,PCR产物利用直接测序法对CYP2C9、维生素K环氧化物还原酶复合物1（VKORC1）及细胞色素P450 4F2酶（CYP4F2）基因进行序列测定,与国际数据库比对分析确定是否存在碱基突变.通过定点诱变方法获得3种典型缺陷型CYP2C9＊2、＊ 3、＊13及新突变型CYP2C9的cDNA,利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System试剂盒,获得高表达各型CYP2C9变异体的昆虫微粒体.Western印迹法进行CYP2C9蛋白定量,以甲苯磺丁脲为探针底物药,体外测定不同药物浓度下各型CYP2C9变异体的最大反应速率（Vmax）和米氏常数（Km）,评价新突变类型对CYP2C9体外代谢活性的影响.结果 患者CYP2C9基因中发现全新的突变类型：1400T＞C,可导致CYP2C9第467位氨基酸发生变异（L467P）,VKORC1及CYP4F2基因无碱基突变.体外代谢实验结果显示,突变体CYP2C9＊2、＊3、＊13和L467P的体外酶学活性分别为野生型的91.58％、13.55％、0.11％和1.59％.结论 1400T＞C突变可大大降低CYP2C9的体外酶学活性,提示携带此突变型的患者在使用经CYP2C9代谢的药物时,药物代谢速度会明显减慢,容易造成体内药物蓄积,发生潜在的药物不良反应.

UPLC-MS/MS测定大鼠血浆中8-O-乙酰山栀苷甲酯浓度

目的建立超高效液相串联质谱法快速测定大鼠体内8-O-乙酰山栀苷甲酯的浓度。方法用乙腈沉淀蛋白方法处理血浆,色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm,1.7μm）;流动相为乙腈-0.1%甲酸水,梯度洗脱,流速为0.4 m L·min^-1;用正离子多离子反应监测（MRM）扫描,内标为槲皮素。结果血浆中8-O-乙酰山栀苷甲酯的线性范围为2.5-500 ng·m L^-1（r=0.997 9）,最低定量限为0.5 ng·m L^-1。低、中、高3个浓度（3,45和450 ng·m L^-1）的质控样品的日内、日间精密度RSD均〈10%,3个浓度的相对回收率分别为（103.59±4.75）%,（98.68±4.62）%和（97.06±5.64）%。结论该方法操作简便、快捷,灵敏度高,适于大鼠血浆中8-O-乙酰山栀苷甲酯浓度的测定及其药代动力学研究。

CYP2C9基因1300A〉T突变对体外药物代谢活性的影响

华法林是目前临床常用的抗凝药物，自20世纪40年代合成以来，该药广泛应用于临床抗凝和抗血栓治疗，至今仍无有效的替代品出现。华法林的有效治疗范嗣较窄，不同个体间维持剂量存在很大的差异，用药不当会导致出血或血栓形成等严重不良事件的发生^[1-2]。近年来研究发现，基因多态性、药物相互作用及饮食等因素都会影响到华法林的临床药效，其中基因多态性是最重要的因素之一[^1-4]。

超高效液相色谱-串联质谱同时检测大鼠血浆中羟基安非他酮、羟基美托洛尔、1-羟基咪达唑仑、对乙酰氨基酚和羟基甲苯磺丁脲

目的以地西泮为内标,使用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定大鼠血浆中羟基安非他酮、羟基美托洛尔、1-羟基咪达唑仑、对乙酰氨基酚和羟基甲苯磺丁脲。方法血浆样品用乙腈沉淀法去除蛋白,色谱分离采用UPLC BEHC_(18)(2.1 mm×50 mm,1.7μm)柱,流动相为乙腈-水(含0.1%甲酸)梯度洗脱,采用电喷雾多反应监测模式定量。结果日间和日内精密度<13%,准确度为94.5%～107.2%,提取回收率在83.2%～92.6%。血浆标准曲线在1 ng/ml～1 000 ng/ml浓度内呈线性,相关系数(r)>0.997。结论该方法可用于5种CYP450亚型探针药物给药后的代谢产物药代动力学研究。

超高效液相串联质谱法测定大鼠血浆中胡麻属苷浓度

目的:建立超高效液相串联质谱法快速测定大鼠体内胡麻属苷的浓度。方法:用乙腈沉淀蛋白方法处理血浆,色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C_(18)柱(50 mm×2.1 mm,1.7μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸水,梯度洗脱,流速为0.4 mL·min^(-1);用正离子多离子反应监测(MRM)扫描,内标为芦丁。结果:血浆中胡麻属苷的线性范围为1~250 ng·mL^(-1)(r=0.998 6),最低定量限为0.2 ng·mL^(-1);胡麻属苷的日内、日间RSD均<10%。大鼠单次灌胃胡麻属苷后,胡麻属苷在大鼠体内的t_(1/2)为(1.35±0.26)h,CL为(8.62±1.25)L·h^(-1)·kg^(-1),AUC_(0-t)为(349.57±48.5)ng·h·mL^(-1);大鼠舌下静注胡麻属苷后,胡麻属苷在大鼠体内的t_(1/2)为(1.45±0.28)h,CL为(2.38±0.57)L·h^(-1)·kg^(-1),AUC_(0-t)为(128.79±30.52)ng·h·mL^(-1),得胡麻属苷的绝对生物利用度为26.6%。结论:该方法经方法学验证,适于大鼠血浆中胡麻属苷浓度的测定及其药代动力学研究。

UPLC-MS/MS快速测定大鼠血浆中的氯沙坦及其代谢产物

目的 建立快速测定大鼠体内氯沙坦及其代谢产物（E-3174）浓度的UPLC-MS/MS方法。方法 Waters XEVO TQD三重四级杆液质联用仪， 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈-水（含0.1%甲酸和0.5%氨水）（60∶40），流速为0.2 mL·min^-1，柱温30 ℃，内标为地西泮；质谱条件：电喷雾离子化源（ESI），正离子检测模式；加入200 μL乙腈沉淀蛋白，13 000 r·min^-1离心10 min转移至1.5 mL EP管中取2 μL上样。结果 E-3174的保留时间为1.54 min，线性范围为6.25～800 ng·mL^-1（r=0.999 8），最低定量限为0.5 ng·mL^-1，回收率为96.6%～98.37%；氯沙坦的保留时间为1.38 min，线性范围为12.5～1 600 ng·mL^-1（r=0.999 6），最低定量限为1.0 ng·mL^-1，回收率为98.4%～100.6%。两者的日内、日间RSD均〈5%，孵育体系中的其他内源性物质不干扰测定。结论 该方法操作简便，重复性好，适于快速测定大鼠体内氯沙坦及其代谢产物浓度。

超高效液相串联质谱法测定大鼠格列美脲及其代谢物的血药浓度

目的建立超高效液相串联质谱法快速测定大鼠体内格列美脲及其代谢物羟基格列美脲的浓度。方法用乙腈沉淀蛋白的方法处理血浆,色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm);流动相为乙腈-0.1%甲酸水,梯度洗脱;流速为0.4 m L·min-1;用正离子多离子反应监测(MRM)扫描,内标为甲苯磺丁脲。结果血浆中格列美脲和羟基格列美脲的线性范围为10~800μg·L-1和1~80μg·L-1(r=0.999 9和0.999 5),最低定量限为2.00μg·L-1和0.50μg·L-1,回收率均为94.05%~105.33%。两者的日内、日间精密度RSD均<8.20%。结论该方法操作简便、快捷,灵敏度高,适于大鼠体内格列美脲及其代谢物的药动学研究。

气相色谱-质谱法检测黑面神对大鼠肝肾机体代谢的影响

目的通过采用气相色谱-质谱法(GC-MS)结合代谢组学方法以阐明南方"傣族"少数民族治疗慢性支气管炎和炎症的民间药物黑面神(大戟科)对大鼠肝肾机体代谢的影响。方法将大鼠分为对照组、黑面神(2 g/kg)组和10%酒精处理组,连续给药7 d。第8 d,从3组大鼠收集肝脏和肾脏样本,衍生化处理后,进行GC-MS分析。结果根据肝脏和肾脏的代谢组学偏最小二乘法鉴别分析(PLS-DA),结果显示黑面神组与对照组和10%酒精处理组区别开来。在肝组织中,黑面神组与对照组之间没有发现差异,而黑面神组与10%乙醇处理组之间的核糖醇和D-葡萄糖含量差异有统计学意义(P<0.05)。在肾组织中,黑面神组相对10%酒精处理组,硬脂酸含量升高(P<0.05)。结论 PLS-DA结果表明,黑面神诱导代谢扰动,而10%的酒精也可能诱发代谢扰动。