GDF-5联合地塞米松诱导大鼠BMSCs向类髓核样细胞分化

目的探讨GDF-5联合地塞米松诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向类髓核样细胞分化潜能及其表型的改变。方法用全骨髓贴壁法及序贯酶消化法分别分离培养大鼠BMSCs和髓核细胞(NPCs),均取P3代细胞分为1)对照组,2)BMSCs+Dex组3)BMSCs+GDF-5组4)BMSCs+Dex+GDF-5组(联合诱导组)5)NPCs组。诱导培养21 d,镜下观察细胞形态及密度变化,阿辛蓝染色检测蛋白多糖,RT-PCR检测COL1、ACAN、SOX9及COL2和髓核细胞阳性基因KRT19、PAX1和FOXF1的表达。Western blot检测COL2及COL1蛋白表达。结果 BMSCs形态呈长梭型、漩涡样生长;NPCs呈球形、岛状生长的特点;诱导后BMSCs向类圆形、三角形转变,细胞体积缩小,胞质颜色与对照组相比逐渐加深;蛋白多糖分泌增加,以联合诱导效果最佳。ACAN、SOX9、COL2基因的相对表达量逐渐增高,ACAN/COL2的比例呈递增趋势,COL1的表达呈递减趋势。NPCs阳性基因KRT19、PAX1、FOXF1与对照组相比(P<0.05)。含GDF-5的诱导组COL2蛋白表达高于对照组(P<0.05),而联合诱导组COL1蛋白的表达最少。结论GDF-5可以诱导大鼠BMSCs向类髓核样细胞分化,且地塞米松能起到显著促进作用,为BMSCs移植治疗椎间盘退变提供了理论依据。

胰高血糖素样肽-1对AGEs诱导H9C2心肌细胞自噬的影响

目的观察胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对晚期糖基化终产物(AGEs)诱导H9C2心肌细胞自噬(Autophagy)的影响,初步探讨GLP-1心肌细胞保护作用与自噬活性关系。方法将传代培养H9C2心肌细胞随机分4组:(1)Control组:加入0.9%生理盐水;(2)AGEs组:加入100 mg·L^(-1)AGEs;(3)AGEs+GLP-1组:同时加入100 mg·L^(-1)AGEs和10 nmol·L^(-1)GLP-1;(4)AGEs+GLP-1+Rapamycin组:同时加入100 mg·L^(-1)AGEs、10 nmol·L^(-1)GLP-1及5μmol·L^(-1)Rapamycin(自噬诱导剂)。各组在经上述预处理24 h后,分别用CCK-8法检测细胞存活率Hoechst 33258试剂盒检测细胞的凋亡率,DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平,流式细胞术检测细胞自噬溶酶体形成,Western blot法检测自噬相关蛋白(LC3Ⅱ,Beclin-1)表达。结果 (1)与Control组相比,AGEs组细胞生存率明显减少,细胞内ROS水平明显增高,细胞自噬溶酶体水平及自噬相关蛋白(LC3Ⅱ、Beclin-1)表达均明显增加;(2)与AGEs组相比,AGEs+GLP-1组细胞生存率明显增高,细胞内ROS水平、细胞自噬溶酶体水平及自噬相关蛋白(LC3Ⅱ、Beclin-1)表达均明显下降;(3)与AGEs组相比,AGEs+GLP-1+rapamycin组中细胞内ROS水平降低,而细胞生存率、细胞自噬溶酶体水平及自噬相关蛋白(LC3Ⅱ、Beclin-1)表达未见差异。结论 (1)AGEs可导致H9C2心肌细胞内ROS升高,诱导细胞损伤并激活细胞自噬;(2)GLP-1对AGEs诱导的H9C2心肌细胞损伤具有保护作用,其保护机制可能与抑制细胞自噬活性有关。

GLP-1拮抗活性氧对AGEs诱导乳鼠成纤维细胞凋亡的保护作用

为研究胰高血糖素样肽-1(Glucogon like peptide-1,GLP-1)对晚期糖基化终产物(Advanced Glycation End Products,AGEs)诱导成纤维细胞凋亡的影响及其机制研究。体外培养成纤维细胞,实验分为5组:正常对照组,200 mg/L AGEs试验组,AGEs(200 mg/L)+GLP-1(5 nmol/L)组,AGEs(200 mg/L)+GLP-1(10 nmol/L)以及AGEs(200 mg/L)+GLP-1(20 nmol/L)组,处理24 h。通过CCK-8比色法检测细胞存活率,相差显微镜观察细胞形态,双氯荧光素(DCFH-DA)染色荧光显微镜摄片观察细胞内活性氧(ROS)水平;运用Hoechst33258检测试剂盒及流式细胞术检测成纤维细胞的凋亡率,Western Blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2的表达量。结果表明:与正常组相比,200 mg/L AGEs组降低成纤维细胞生存率,活性氧(ROS)生成量增加;与AGEs组相比,AGEs+GLP-1组成浓度依赖性提高细胞生成率,活性氧(ROS)含量减少。与正常组相比,AGEs组导致促凋亡蛋白Caspase-3增加,抑制凋亡蛋白Bcl-2减少,细胞凋亡率升高;AGEs+GLP-1组较AGEs组下调促凋亡蛋白Caspase-3,上调抑制蛋白凋亡Bcl-2,细胞凋亡率减少。由此可见,GLP-1可以通过拮抗活性氧(ROS)发挥对AGEs诱导的成纤维细胞凋亡的保护作用。

低氧对人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响

目的探讨低氧对人骨髓间充质干细胞(hB MSCs)向神经细胞分化的影响。方法将第2代hB M-SCs进行传代、纯化,取第4代hB MSCs进行流式细胞仪检测鉴定;以含1%FBS的α-MEM为基础诱导培养基,根据处理条件不同分为4组:常氧对照组、低氧对照组(3%氧浓度)、常氧诱导组[添加20 ng/mL表皮生长因子(EGF)及20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bF GF)]、低氧诱导组(3%氧浓度下添加20 ng/mL EGF及20 ng/mL bF GF)。连续诱导3 d后,采用RT-PCR及Western blot技术检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP-2)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在基因及蛋白水平表达变化。结果第4代hB MSCs流式鉴定结果示:骨髓基质标志CD105、CD90、CD29表达分别为95.8%、98.2%、95.1%,而造血细胞标志CD19表达为0.2%;与常氧对照组比较,低氧对照组NSE、MAP-2、GFAP在基因及蛋白水平表达均无明显改变(P>0.05),而常氧诱导组及低氧诱导组相应表达均升高(P<0.05),且低氧诱导组表达高于常氧诱导组(P<0.05)。结论低氧促进EGF联合bF GF对hB MSCs向神经元细胞及神经胶质细胞分化的诱导作用。

Wnt/β-catenin信号通路在低氧促进hBMSCs体外增殖中的作用

目的探讨持续低氧环境对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,h BMSCs)体外增殖的影响,并初步探讨Wnt/β-catenin信号通路在其中的作用。方法将购自江阴齐氏生物科技有限公司第2代h BMSCs进行传代、纯化,取第4代h BMSCs进行流式细胞仪检测鉴定;根据培养条件不同分为常氧组(20%氧浓度)和低氧组(3%氧浓度);CCK-8法测定各组生长曲线;采用RT-PCR检测Wnt/β-catenin信号通路关键组件β-catenin、cyclin D1 m RNA表达水平;Western blot检测β-catenin、P-β-catenin蛋白表达水平。结果第4代h BMSCs流式鉴定结果显示:骨髓基质标志CD90表达为98.7%,而造血细胞标志CD19表达为0.3%;与常氧组比较,低氧组增殖速率更快,β-catenin、cyclin D1 m RNA表达升高(P<0.05),β-catenin蛋白表达升高(P<0.05),P-β-catenin蛋白表达下降(P<0.05)。结论持续低氧环境可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路而促进h BMSCs体外增殖。

间充质干细胞治疗糖尿病足溃疡的Meta分析

目的以Meta分析系统评价间充质干细胞(MSC)治疗糖尿病足溃疡(DFU)的疗效。方法通过计算机检索Pubmed、Web of Science、OVID数据库、Embase、Medline、Cochrane Central、中国知网、中国生物医学数据库等数据库,自建库至2018年11月份的随机对照试验进行系统评价。结果共纳入8个随机对照临床试验。Meta分析结果显示,与对照组相比,MSC疗法可增加溃疡愈合率[OR(95%CI)2. 50(1. 26~4. 97),P<0. 01],减少溃疡面积[加权均数差值(WMD)=―3. 510,95%CI(―4. 654~―2. 366),P<0. 01],针对难治性溃疡有显著的疗效,改善踝肱指数[WMD=0. 11,95%CI(0. 07~0. 15),P<0. 01],提高经皮氧分压[标化均数差值=1. 82,95%CI(1. 28~2. 37),P<0. 01],改善患肢血流情况,提高无截肢生存率[OR(95%CI)0. 11(0. 02~0. 61),P<0. 05];无明显不良反应。结论 MSC疗法可促进DFU伤口愈合,改善局部循环,提高无截肢生存率,是DFU有效的综合治疗对策。