动物生物化学实验教学改革探索与实践

针对当前动物生化实验教学内容、教学方法和教学模式中存在的问题,从更新实验内容,改革实验教学手段、教学模式和考试方法、强调课程的实践训练等几方面对课程教学进行全面的探索。将基础性实验、综合性实验和设计性实验3个层次有机地结合起来,形成由浅入深、从易到难的递进式分阶段教学模式。经过改革,学生对实验课的学习由被动接受变为主动探究,在培养学生的创新能力和实践能力方面具有重要意义。

动物遗传学课程教学改革探索

动物遗传学是动物科学专业本科生的一门重要专业基础课。由于近年高校改革和本学科的飞速发展,该课程教学的改革已成为必然趋势。为了能够更好地改进该课程教学,适应学科发展,使授课质量得到进一步提高,从教学内容的优化与重组,选择合适教材,改革完善课程的理论和实验教学方法和教学手段及完善考核评价制度等方面提出了改革设想。

《动物生物化学》开放性实验的探究

针对动物生物化学实验传统教学模式的不足,结合实验教学改革和实验室开放平台的建设,对开放性实验的开展进行了一些探索,建立了课内和课外多种开放性实验模式。开放性实验的开展对激发学生的学习兴趣,培养学生的创新能力和实践能力具有良好的效果,对提高实验教学质量具有积极的作用。

灵活运用思维导图提升《动物生物化学》教学质量

针对课程特点,结合教学现状,在《动物生物化学》教学实践中引入并灵活应用思维导图教学方法,把枯燥的理论知识转化为丰富多彩的知识网络图画,激发学生学习兴趣。科学合理选取核心主题是构建思维导图的关键要素,可选取章节内容、代谢关键物质或生活案例为核心词,建立知识间的逻辑关系,梳理知识脉络,分层储存知识,扩展思维空间,构建知识体系,从而达到教学相长,提升教学品质的最终目标。

潜移默化培养研究生学术诚信教学探析

诚信是践行社会主义核心价值观的重要内容,研究生科研诚信的培养直接影响着学术科研优良风气的传承与发展。研究生科研诚信的培养首先应从入学教育开始,使学生了解有关学术诚信的规章制度、法律法规,对学术诚信产生敬畏感;其次,在日常教学环节不断分析研究生出现学术不端行为的成因,建立相应的约束机制,贯彻科研诚信的思想;最后,师生协同营造严于律己、坚决抵制学术不端行为的科研气氛,从而潜移默化培养学生从敬畏心理到自觉行为的科研诚信准则。

动物生物化学实验室开放的初步探索

实验室是高等院校培养学生全面发展的重要组成部分之一,开放实验室是提高学生实验基本操作技能、深化实验教学改革的重要途径。本文结合近几年动物生物化学实验室开放的工作经验,对实验室开放的意义、措施、效果及存在问题进行探讨,以求加快实验室开放的步伐,更好地促进创新型人才的培养。

云南德宏水牛和杂交牛(摩拉水牛×德宏水牛)血清中两种同工酶的多态性研究

本试验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对云南德宏水牛和杂交牛(摩拉水牛×德宏水牛)血清中乳酸脱氢酶(LDH)和过氧化物酶(POD)两种同工酶多态性进行研究,并采用GelDocTM.XR凝胶成像系统扫描仪对乳酸脱氢酶进行定量。结果表明两种牛血清中的两种同工酶均出现多态性,且德宏水牛血清同工酶多态性少于杂交牛。德宏水牛LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5相对百分含量依次为47.25±1.62%、25.41±0.75%、14.07±0.49%、10.55±0.97%、5.98±0.45%;杂交牛依次为49.27±0.85%、26.26±0.55%、12.48±0.40%、8.89±0.52%、6.35±0.27%。对LDH相对百分含量进行方差分析的结果显示,两种牛之间只有LDH3差异显著(P<0.05),其余差异均不显著(P>0.05)。该结果为进一步研究血清同工酶的多态性与生产性能之间的关系提供了理论依据。

大围山微型鸡、云龙矮脚鸡和拉伯高脚鸡mtDNA D-loop遗传多样性分析

大围山微型鸡、云龙矮脚鸡和拉伯高脚鸡是近年在云南发现的地方鸡遗传资源,具有优良的种质特性,为了阐明其群体遗传背景,采用mtDNA D-loop区序列为遗传标记,对采自3个地方鸡的共257个样品进行了检测分析。结果表明:大围山微型鸡、云龙矮脚鸡和拉伯高脚鸡的单倍型多样度分别为0.083±0.018、0.851±0.029和0.784±0.039;核苷酸多样度分别为0.014 67±0.000 45、0.013 42±0.000 80、0.011 66±0.001 55;群体内遗传距离分别为0.014±0.003、0.014±0.003、0.012±0.003。中介网络分析显示:本研究检测的257个样品分布在A、B、C、D、E、F和G等7个世系中,其中大围山微型鸡包含A、B、C、D、E、F和G等7个世系,B、D世系为其主要世系;云龙矮脚鸡包含A、B、C、E、F和G等6个世系,E世系为其主要世系;拉伯高脚鸡包含A、B、E和G等4个世系,G世系为其主要世系。AMOVA分析表明:3个群体间遗传分化指数(Fst)分别为0.120 84、0.239 46、0.263 68(P<0.01),群体内遗传变异占80.61%,群体间变异为19.39%(P<0.01)。本研究结果揭示3个地方鸡群体遗传多样性较丰富,都含有多个母系血统,支持家鸡多个母系起源的观点,但它们之间存在较大的遗传分化。

水牛乳和荷斯坦牛乳中五种常量元素含量的测定

对摩本杂水牛（摩拉水牛×德宏水牛）乳和荷斯坦牛乳中的5种常量元素进行测定。采用火焰光度法测定钾、钠含量,火焰原子吸收分光光度法（FAAS）测定钙、镁含量,磷钼酸比色法测定磷含量。结果表明,水牛乳中钾、钠含量极显著低于荷斯坦牛乳（P〈0.01）,钙、磷含量极显著高于荷斯坦牛乳（P〈0.01）,两种牛乳中镁含量差异不显著（P〉0.05）。元素测定相对标准偏差（RSD）低于5%,平均加标回收率在95.05%～105.18%之间。

猪α干扰素基因克隆、进化及表达特性分析

为深入研究α干扰素在猪体内的调节和功能,本研究以猪为实验动物,通过RT-PCR扩增得到α干扰素基因全长编码区序列,提交Gen Bank数据库,获得登录号为"JQ839262"。生物信息学分析显示,该基因编码189个氨基酸,预测蛋白分子量为21.32 ku,等电点为6.37。蛋白质结构分析得出,IFN-α存在1个保守域,无跨膜结构,存在信号肽。疏水性分析显示其N端疏水,C端亲水。亚细胞定位显示,该蛋白分泌到细胞周质的概率为92.2%。系统进化分析表明,猪与牛、山羊的亲缘关系较近。同时通过荧光定量PCR法检测了α干扰素基因mRNA在猪13个组织中的表达量,发现在皮肤、肺、肌肉、心、脾中表达量较高。本研究为进一步研究猪α干扰素基因的表达调控奠定研究基础。

猪胰岛素样生长因子-Ⅰ的克隆及生物信息学分析

为了克隆猪胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-I)以及检测该因子在各组织中的转录水平,分别提取猪13种组织RNA并反转录为cDNA,利用RT-PCR方法扩增IGF-I编码区全长序列,将纯化的片段与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH 5α,筛选阳性克隆并测定其序列,利用生物信息学方法分析其序列特征,并与牛等5个物种构建系统进化树。同时采用半定量RT-PCR方法分析IGF-I在猪13种组织中的表达情况。结果显示,猪IGF-I编码区全长462 bp(GenBank登录号:JX827417),编码153个氨基酸。氨基酸二级结构预测表明无规卷曲占的比例最大,为57.52%。氨基酸序列同源性分析表明,与牛、马、羊、鹿、鸡等5个物种的相似性分别为98.0%、97.4%、96.1%、96.1%、83%,多组织半定量RT-PCR研究表明IGF-I mRNA在猪的13个组织中均有表达,其中在肌肉、肝脏、脾脏、卵巢、大肠中表达量较高,其他组织略低。

水牛初乳和常乳中锌、铁、铜含量的动态变化

采用火焰原子吸收分光光度法对摩本杂水牛(摩拉水牛×德宏水牛)初乳和常乳中Zn、Fe、Cu等三种微量元素含量进行测定。结果表明,在第1、2d的初乳中Zn含量显著高于其余几天的初乳和常乳(P<0.05),第3d开始Zn含量接近常乳,在3d至90d之间稍有波动,但差异不显著(P>0.05)。Fe和Cu含量随泌乳进行逐渐降低,其在初乳中的含量均高于常乳,常乳之间差异不显著(P>0.05)。其中第1d初乳中Fe含量显著高于第7d(P<0.05),而与其余几天初乳相比差异不显著(P>0.05),第1、2d初乳中Fe含量均显著或极显著高于常乳(P<0.05);第1d初乳中Cu含量显著高于第3、5d的初乳(P<0.05),与第2、7d相比差异不显著(P>0.05),第1、2d初乳中Cu含量极显著高于常乳(P<0.01)。研究显示水牛初乳中Zn、Fe、Cu等三种微量元素的含量大都高于常乳,反映了乳腺在初乳期矿物质的分泌特点。

德宏奶水牛DGAT1基因多态性及其与产奶性状的相关性分析

探讨德宏奶水牛(摩拉水牛×德宏水牛)DGAT1基因多态性与产奶性状的关系,以期为德宏奶水牛产奶性状标记辅助选择侯选基因的选择提供理论依据。以81头泌乳的德宏奶水牛为研究对象,利用PCR-SSCP方法结合候选基因直接测序法检测DGAT1基因第8外显子及第8内含子区的多态性,并采用最小二乘法分析DGAT1基因多态位点对产奶量、乳脂率及乳蛋白率的影响。结果在德宏奶水牛群体中共检测到CTGG,CCGG和CCGT三种基因型,测序结果显示,在检测的群体中未发现K232A位点的突变,而在DGAT1基因第8内含子的第14位检测到C→T突变,第35位检测到G→T突变。多重比较表明,CCGT基因型对德宏奶水牛的乳脂率有显著影响(P<0.05)。

河流型与沼泽型水牛CSN3基因密码子使用特征分析

本研究以54头河流型水牛和70头沼泽型水牛为研究对象,并以从NCBI数据库中下载的普通牛、野牦牛、野牛、绵羊、小鼠和人的序列作对照,对乳成分中重要的κ-酪蛋白(kappa casein)编码基因CSN3的密码子使用偏好性及水牛与其他物种间CSN3基因密码子使用的差异和进化关系进行了深入分析。结果表明:两种类型水牛CSN3基因密码子使用特征相似,河流型水牛CSN3基因共有26个偏好使用的密码子,而沼泽型水牛共有27个;其中,两类水牛偏好性较强的密码子均为GUU、UCA、AGU、CCA、AGG、GGU和GGA(RSCU≥2),河流型水牛对Asp的两种密码子GAU、GAC没有使用偏好性,而沼泽型水牛偏好使用GAC;河流型水牛编码Asp和Cys的同义密码子RSCU值为1,而沼泽型水牛只有编码Cys的同义密码子RSCU值为1。研究发现,所有物种CSN3基因均偏好使用以A/U结尾的密码子,但不同物种之间偏好使用密码子种类和数目均有差异。在密码子使用频率上,水牛CSN3基因与其他牛科物种的差异小于与小鼠、人的差异。密码子使用偏好聚类分析表明,河流型与沼泽型水牛亲缘关系最近,聚为一类,然后依次与其他牛、绵羊、小鼠和人等物种相聚。

火焰原子吸收光谱法测定水牛和荷斯坦牛乳中锌、铁、铜含量

研究采用火焰原子吸收分光光度法（FAAS法）测定水牛和荷斯坦牛乳中锌、铁、铜含量。结果表明,锌、铁、铜含量在水牛乳中分别为15.520μg/mL、4.267μg/mL、0.586μg/mL,在荷斯坦牛乳中分别为4.374μg/mL、2.756μg/mL、0.866μg/mL。水牛乳中锌、铁含量极显著高于荷斯坦牛乳（P〈0.01）,铜含量极显著低于荷斯坦牛乳（P〈0.01）。三种元素的回收率范围为96.000%~104.333%,相对标准偏差为2.467%~7.857%。该方法精密度和准确度高,可适用于批量牛乳样品中微量矿物元素的分析。

绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a-AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES-AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a(+)构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达绿色荧光蛋白,经15%SDS-PAGE鉴定,结果显示:重组质粒pET32a-AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES-AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a-AcGFP1转化Rosetta(DE3),经不同浓度的IPTG诱导,SDS-PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+)-TAT-AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。

人骨髓胚胎样干细胞向多核肌纤维诱导分化的研究

目的:比较骨髓来源的胚胎样干细胞(ELSCs)与间充质干细胞(MSCs)的体外成肌分化能力。方法:采用胚胎干细胞扩增用的无血清Knockout-DMEM培养基在明胶包被过的培养瓶中培养人骨髓单个核细胞以分离ELSCs,传统方法从相同骨髓中分离MSCs,倒置相差显微镜下观察细胞形态特征,采用免疫荧光染色鉴定多潜能抗原标志的表达。成肌分化液分别培养ELSCs和MSCs,采用免疫染色法检测肌纤维特异性抗原标志肌球蛋白重链(MHC)、成肌素(myogenin)和MyoD蛋白的表达,RT-PCR检测MHC、myogenin和MyoD mRNA的表达,计算MHC阳性肌纤维的比例以比较ELSCs与MSCs的体外成肌分化能力。结果:无血清培养基可从骨髓中分离到弱表达多潜能抗原标志Oct-4、Nanog-3和Sox-2的ELSCs,体积较小,形态纤细均一,在形态方面不同于相同骨髓来源的MSCs,后者不表达多潜能抗原标志。在成肌分化液中培养,ELSCs和MSCs均可被诱导为在蛋白和mRNA水平表达MHC和myogenin的多核肌纤维,但诱导培养10 d时,ELSCs的MHC蛋白阳性肌纤维的比例为(25.7±4.1)%,MSCs为(15.8±7.6)%,ELSCs的成肌分化能力明显高于MSCs(P<0.05)。结论:骨髓ELSCs能被诱导为多核肌纤维,并具有比来自相同骨髓的MSCs更强的成肌分化能力,ELSCs是肌病治疗更理想的种子细胞。

猪白细胞介素6和α干扰素基因的融合及其原核表达

为了获得猪白细胞介素6(IL6)和α干扰素(IFNα)双重活性的融合蛋白,研究其作为免疫佐剂的可行性,利用IL6和IFNα基因的编码区序列以及原核表达载体pET32a序列,设计了带有限制性内切酶位点、Linker序列以及His标签的特异性引物扩增出猪IL6和IFNα的成熟肽基因序列,并分别与克隆载体pMD18连接后转化Esche-richia coli DH5α,提取质粒酶切并连接构建重组质粒pMD18-IL6-IFNα。将该重组质粒和表达载体pET32a同时酶切并连接构建pET32-IL6-IFNα重组质粒,依次转化E.coli DH5α和E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,并经不同终浓度的IPTG以及不同时间的诱导表达。结果成功构建了IL6和IFNα的融合表达载体,SDS-PAGE检测pET32-IL6-IFNα融合蛋白在E.coli Rosetta(DE3)中得到了较高表达,且经1.00 mmol/L IPTG诱导7.0 h后表达量最大,目的蛋白的相对分子量为44 960,与理论预期值一致。SDS-PAGE检测显示融合蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。

Duchenne型肌营养不良小鼠模型鉴定及干细胞移植后dystrophin的变化

目的建立Duchenne型肌营养不良(DMD)模型dko小鼠的鉴定方法,评估干细胞移植后dystrophin的再生水平。方法采用SSP-PCR方法鉴定杂合子鼠交配产生的子代鼠的基因型。生化分析仪测定dko小鼠血浆肌酸激酶含量,HE染色观察肌肉组织学变化。扩增人脐带间充质干细胞并注射到dko小鼠后肢肌肉,2个月后免疫荧光染色法检测dystrophin的表达。结果杂合子鼠交配可以产生三个基因型的子代鼠,21.2%的子代鼠可以鉴定为dko小鼠的基因型(285 bp)。dko小鼠显示了肌营养不良的症状,血浆肌酸激酶含量高达(16,988.52±617.48)IU/L,典型的病理变化包括肌纤维大小不一,多见核中移细胞,结缔组织增生或炎性细胞浸润。将人脐带间充质干细胞注射到dko小鼠后肢肌肉,2个月后可检测到人dystrophin的表达。结论采用SSP-PCR可用于鉴定dko小鼠基因型,dko小鼠是研究干细胞治疗DMD的理想动物模型。

槟榔江水牛、摩拉水牛和荷斯坦牛乳成分比较分析

本试验采用乳品分析仪对槟榔江水牛、摩拉水牛和荷斯坦牛乳蛋白、乳脂和乳糖等含量进行测定。同时采用SDS-PAGE技术对乳蛋白各组分进行分离,并利用凝胶成像系统进行扫描定量。结果表明,槟榔江水牛和摩拉水牛乳蛋白、乳脂含量差异不显著(P>0.05),槟榔江水牛乳糖含量显著低于摩拉水牛(P<0.05);而水牛乳蛋白、乳脂和乳糖含量均极显著高于荷斯坦牛乳(P<0.01)。酪蛋白百分含量在三种牛乳蛋白中占优势,并且水牛乳CN和β-LG百分含量与荷斯坦牛乳差异不显著(P>0.05);而水牛乳中其他蛋白组分含量则显著高于荷斯坦牛乳(P<0.05)。