巍山红雪梨PpPAL基因的克隆及生物信息学分析

为了进一步研究红皮梨花色素苷的合成调控机制，以巍山红雪梨为试验材料，采用同源克隆方法，克隆得到了苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因的cDNA片段，名之为PpPAL，登录号为JQ749640，并利用相关生物软件对该基因及其相应蛋白质进行了生物信息学分析。结果表明：PpPAL长1919bp，编码628个氨基酸；其与西洋梨eyrus communis的PAL基因（DQ230992）、鸭梨Pyrus bretschneideri的PAL基因（GU906268、JQ247318）、甜樱桃Prunus avium的PAL基因（AF036948）和覆盆子Rubus idaeus的PAL基因（AF237955）在核苷酸水平上的同源性分别为98％、95％、95％、88％和83％。氨基酸序列比对中发现，PAL序列包含L180、V181、L230、A231等脱氨基氨基酸残基，其催化活性位点分别为N234、G235、N356、D357、N358、H370、HNQDV（460～464）。PpPAL基因不存在导肽和信号肽，无跨膜结构域，定位于细胞质中，肽链表现为亲水性；α-螺旋和无规则卷曲是其蛋白质二级结构中量最大的结构元件，β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中。在对其编码的蛋白的预测中发现，该蛋白含有苯丙氨酸解氨酶．组氨酸解氨酶（PAL-HAL）和苯丙氨酸解氨酶（phe-am-lyase）。

云红梨1号HY5基因原核表达载体的构建、表达和纯化

HY5为调控光形态建成的转录因子,调控花青素的生物合成与累积。通过构建云红梨1号HY5基因的原核表达载体,旨在为研究HY5蛋白的生物功能奠定基础。将云红梨1号的HY5基因构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,并对其进行诱导表达,通过谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和层析色谱柱纯化融合蛋白。结果表明,重组质粒pGEX-4T-1-PyHY5的酶切检测及测序结果均正确,表明重组质粒载体构建成功。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,用100 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃、220 r/min条件下诱导3 h后收集诱导菌株,在BL21菌株中均有明显的目的条带,诱导表达后的融合蛋白大小约为43.90 ku;PyHY5蛋白能够与pGEX-4T-1载体上的GST标签蛋白进行融合表达。通过研究成功构建了pGEX-4T-1-PyHY5原核表达载体,诱导表达并纯化出PyHY5融合蛋白为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

PyHY5基因遗传转化矮牵牛的条件筛选与优化

本研究以矮牵牛‘轻浪’(Easy wave)和‘超级小瀑布’(Supercascade)两个不同品种的无菌苗叶片作为试验材料,采用叶盘转化法进行试验。设置不同的侵染时间(5,10,15,20 min)和潮霉素浓度(5,10,15 mg/L),培养40 d,统计矮牵牛叶片的转化率,筛选出PyHY5基因遗传转化矮牵牛的适宜条件。结果表明,‘轻浪’的转化率较高,侵染时间为10 min、潮霉素的浓度为10 mg/L时,最终的遗传转化效率为5%,适合作为矮牵牛的遗传转化条件,这为Py HY5基因的进一步研究提供参考。

“云红梨1号”HY5基因的克隆及生物信息学分析

以“云红梨1号”的外果皮为试材,采用PCR技术,克隆出“云红梨1号”HY5基因cDNA的序列,进行生物信息学分析,研究了HY5基因的长度、编码、分子量、蛋白结构,并对HY5基因编码蛋白同源性进行了比较,以期为进一步对“云红梨1号”HY5基因功能和依光型花青素合成的机理研究奠定基础。结果表明:“云红梨1号”HY5基因全长为495bp,编码164个氨基酸,其分子量为17.90kD,为亲水蛋白,具有bZIP结构域;与苹果HY5基因具有高度的同源性,编码蛋白相似性为93%,表明其具有相类似或相同的功能。