昆明盐矿古老岩盐沉积中的原核生物多样性

应用PCR-DGGE和rRNA分析法研究了昆明盐矿古老岩盐沉积中的原核生物多样性。样品的细菌DGGE分析得到27条带,古菌得到18条带。样品与纯培养得到的19个属菌株的DGGE图谱对比分析发现,细菌18个属菌株,只有1个属菌株与样品中的1条带迁移位置都不一致;古菌1个属的菌株不与样品中任何条带迁移位置一致。表明纯培养所得菌株并非该环境中的优势类群。同时,建立了样品细菌和古菌的16S rDNA克隆文库,从中分别挑取36个细菌克隆和20个古菌克隆进行ARDRA分析。细菌可分为10个OTUs,其中3个OTUs是优势类群,分别占38.9%,25.0%,16.7%,其余7个OTUs各含有1个克隆。古菌分为8个OTUs,没有明显的优势类群。每个OTU的代表克隆16S rDNA序列分析表明,细菌分属3大类群:α-Proteobacteria,γ-Proteobacteria和Actinobacteria,以Pseudomonas属菌为优势,含有其它岩盐沉积中没有发现的Actinobacteria。古菌主要是Halorubrum属、Haloterrigena属菌和未培养古菌。本研究表明,昆明盐矿古老岩盐沉积具有较丰富的原核生物多样性,含有大量未知的、未培养或不可培养的原核生物,但在原核生物物种组成和丰度上,免培养与此前的纯培养研究结果存在一定差异。因此,结合使用两类方法才能较全面地认识高盐极端环境微生物的多样性。

一平浪盐矿古老岩盐沉积中可培养细菌的系统发育多样性研究

运用纯培养法和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析对云南省一平浪盐矿古老岩盐沉积中可培养细菌的多样性进行了研究。用补充0.5-3.5mol/L NaCl的MBA和ISP2琼脂培养基从卤水、岩盐和盐土样品中分离到38株细菌,用细菌通用引物进行16S rRNA基因扩增和序列测定,用相关软件进行序列相似性搜索、比对和系统发育分析。结果表明,38个分离菌株可分为31个物种,属于4个大的系统发育类群（Proteobacteria,Bacteroidetes,Firmicutes,Actinobacteria）、17个科、24个属。多数菌株属于Proteobacteria门（18株,47.3%;Gamma-Proteobacteria,31.5%;Alpha-Proteobacteria,15.8%）和Firmicutes门（13株,34.2%）。这些分离菌株中,至少有3个菌株可能代表3个不同属的3个新物种：Y3、Y15和Y25分别代表Idiomarina属、Salinicoccus属和Saccharospirillum属的新物种;而菌株Y21有可能代表Staphylococcaceae科的一个新属。从以上结果可以看出,一平浪盐矿古老岩盐沉积中存在较为丰富的微生物物种多样性和系统发育多样性,并且潜藏着新的微生物资源。

昆明盐矿古老岩盐沉积中可培养细菌多样性研究

为了了解昆明盐矿古老岩盐沉积中可培养细菌的多样性，用MBA和ISP2分离和培养了昆明盐矿卤水和盐晶中的细菌44株。发现盐晶中的可培养好氧细胞数量（3．1×10^3～3．7×10^6CFU／g）远远高于卤水中的数量（1．3-6．3×10^3CFU／L）。分离所得纯培养物的16S rDNA序列系统发育分析结果表明，44株菌可分为4大类群34个不同的分类单元（16S rDNA序列相似性大于97％为同一分类单元）。24株属于厚壁菌门（Firmicutes，54．6％），2株属于变形菌门α亚群（α-Proterbacteria，4．6％），4株属于变形菌门γ亚群（γ-Proterbacteria，9．1％），14株属于放线细菌门（Actinobacteria，31．7％）。卤水和盐晶中的优势菌都是Bacillus属菌（26．1％和59．9％）。据16S rDNA序列相似性分析发现7株菌为可能的新种或属。此外，还筛选到7株抗菌活性菌株。研究表明，昆明盐矿古老岩盐沉积中，不仅含有较为丰富的微生物物种多样性，并且存在许多未被认识的新物种和生物活性菌株，为古老岩盐沉积中微生物的深入研究奠定了基础。

青海盐碱环境中具抗肿瘤活性放线菌的筛选和多样性研究

从我国青海省采集盐碱土样或泥样,用添加1.0~3.0mol/L NaCl的GPY琼脂培养基和ISP2琼脂培养基分离到145株典型放线菌菌株。采用6种肿瘤细胞株对分离菌株的发酵产物进行体外筛选,得到26株抗肿瘤活性阳性菌株（17.9%）,19株为拟诺卡氏属（Nocardiopsis）菌株,7株为链霉菌属（Streptomyces）菌株。在抗肿瘤活性、形态特征、生理生化特性和全细胞水解物氨基酸组分分析等实验结果的基础上,选取差异较大的8株抗肿瘤活性阳性菌株进行16S rRNA基因序列测定和系统发育多样性分析。结果表明,2株属于链霉菌属（Streptomyces）的1个已知物种和1个潜在新种;6株属于拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）,可能代表该属的4个新种。研究表明青海盐碱环境中存在产生抗肿瘤活性物质的重要放线菌资源,也提示其中蕴藏着较丰富的微生物多样性。

具抗肿瘤活性放线菌菌株YIM 90022的分离和系统发育分析

从青海盐碱土壤样品中分离到一株兼性嗜碱放线菌YIM 90022，该菌株的发酵产物具有很强的体外抗胃癌、肺癌、乳腺癌、皮肤癌、肾癌和子宫癌肿瘤细胞株活性。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明，菌株YIM 90022属于拟诺卡氏属（Nocardiopsis）的成员，与该属的4个有效发表种N．exhalans DSM 44407^T，N．prasina DSM 43845^T，N．metallicus DSM 44598^T和N．listeri DSM 40297^T系统发育关系最密切，与其分别以98．8％，98．5％，98．4％和97．8％的16S rRNA基因核苷酸序列相似性聚为一簇。但菌株YIM 90022不与这4个有效种中任何一个单独相聚，形成了一个独立亚分枝。结合形态特征、生理生化特性、细胞化学分类特征，以及rep-PCR基因指纹分析等方面的研究结果，菌株YIM 90022可能为拟诺卡氏菌属的一个潜在新种。菌株YIM 90022在大多数培养基上生长良好，气生菌丝和基内菌丝丰富，在酵母膏麦芽膏琼脂、燕麦片琼脂等培养基中产生可溶性色素。生长pH范围6．0．12．0，最适pH8．5；能在含0—15％NaCl（W／V）的培养基上生长。

具抗菌活性海洋放线菌菌株JMC 06001的分离和鉴定

从湛江硇洲岛高盐泥样中分离到一株微嗜盐放线菌JMC 06001,该菌株的发酵产物具有很强的抗菌活性。菌株JMC 06001在多数培养基上生长良好,气生菌丝白色,基内菌丝淡黄色至浅棕色。在燕麦琼脂(ISP 3)、甘油-天门冬酰胺琼脂(ISP 5)、葡萄糖-天门冬酰胺琼脂及马铃薯浸汁琼脂上产生黄色可溶性色素,在酵母膏-麦芽膏琼脂(ISP2)、蛋白胨酵母膏铁盐琼脂(ISP6)和营养琼脂上产生棕色可溶性色素。生长温度范围为4℃～40℃,最适生长温度28℃。生长pH范围为6.0～9.0,最适pH 7.0。能在含0～1.5 mol/L NaCl的培养基上生长,最适生长盐浓度为0.2～0.5 mol/L NaCl。根据其形态学特征、生理生化特征、细胞化学分类特征和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析结果,菌株JMC 06001被鉴定为链霉菌属(Streptomyces)的有效发表种波赛链霉菌(S.peucetius)的一个菌株。

三种动物粪便及一种虫体可培养放线菌的多样性及其生物活性

【目的】分析大熊猫、斑马和竹鼠粪便及竹虫的可培养放线菌多样性及其生物活性,探索其作为资源开发利用的可能性。【方法】采集大熊猫、斑马和竹鼠的新鲜粪便及竹虫幼虫,用4种培养基分离放线菌。测定代表菌株的16S rRNA基因序列,并进行系统发育分析,将菌株鉴定到属。测定了分离菌株的水解活性和多种酶活。【结果】共获得121株放线菌,选取的47株代表菌株经系统发育分析,被鉴定为放线菌的9个属。从竹鼠粪便分离到6个已知稀有放线菌属菌株。从其它动物粪便中共分离到4个可能新种。121株菌的水解活性和酶活性不仅高且多样。部分菌株能很好的降解鸡毛和纤维素。【结论】动物粪便放线菌不仅对动物食物的消化吸收有重要作用,也可作为探索工业产品包括酶制剂和生物活性物质的开发资源。

高温环境样品总DNA直接和间接提取方法的比较

分别采用两种环境总DNA直接提取法和一种间接提取法从6种温泉菌席样品中提取总DNA,以DNA粗产物的纯度、能否用于后续PCR扩增及PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)所反映的微生物多样性为评价指标对两类方法进行比较和评价。研究发现,虽然间接提取法效率低下,但对于高温极端环境中生物量较小的样品,间接法能得到有研究价值的、纯度较高的环境样品总DNA,而直接法得到的DNA量小且不适于PCR扩增操作。在使用这2类方法都能得到可用于研究操作的DNA的情况下,间接提取法能更好的体现环境样品中微生物的多样性。

植物内生放线菌多样性研究

放线菌药物开发遇到越来越大的困难.植物内生放线菌是一类研究较少,但很有开发潜力的资源.叙述内生放线菌的宿主多样性,物种多样性,产物多样性,并对值得重视的问题进行了探讨.

药用植物内生放线菌的分离、筛选及活性菌株YIM 61470鉴定

从云南西双版纳热带雨林多种药用植物中分离到272株内生放线菌,活性筛选表明146株菌的发酵产物具有抗菌活性,其中94株菌具有拮抗病原细菌活性,127株菌具有抑制病原真菌的功能。分离菌株YIM 61470具有广谱抗菌活性,通过形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞化学分类特征和基于16S rRNA基因序列的相似性分析等研究,菌株YIM 61470被鉴定为链霉菌属(Streptomyces)氢化链霉菌(S.hydrogenans)的一个菌株。

喜树内生放线菌多样性及抗菌活性评价

从采集于云南大学的喜树中分离到了90株内生放线菌,经16SrRNA基因序列分析鉴定,分布于6个科10个属。对所有分离到的菌株进行抗菌活性检测,发现33.4%的菌株有抗菌活性。通过PCR方法,检测了PKSⅠ、PKSⅡ和NRPS基因,阳性检出率分别为31.1%,48.9%和45.6%。

灯台树内生放线菌多样性及抗菌活性评价

从云南西双版纳采集7份灯台树样品,经过表面消毒,用4种分离培养基分离得到105株内生放线菌。经16S rRNA基因序列分析鉴定,分布于7个科9个属。利用5种植物病原真菌指示菌对所有菌株的发酵液进行抗菌活性检测。结果显示,有12.4%、14.3%、11.4%、12.4%、8.6%的菌株分别对镰刀霉、疫霉、赤星霉、苹果炭疽、白色念珠菌有抗性。对3株具有广谱抗菌活性的菌株进行再次发酵和抗菌活性复筛,结果显示这3株的抗菌活性稳定,并可能含有生物碱类化合物。

具抗肿瘤活性中度嗜盐菌YIM 80186的分离和系统发育分析

从青海盐碱土壤样品中分离到1株中度嗜盐放线菌YIM80186，该菌株的代谢产物具有很强的抗肿瘤和抗菌活性．菌株YIM80186在添加20～100g/L NaCl的培养基上生长良好，而在未添加Naa的多数培养基上生长微弱．最高能耐受200g／L NaCl．气生菌丝和基内菌丝丰富，白色至黄白色．气生菌丝产生直的或弯曲的孢子链，基内菌丝发育良好，断裂,生长pH范围6．0～10．0，最适pH7．5～8．0．通过对其进行的包括形态、生理生化特性、细胞化学以及基于16SRNA基因序列的系统发育分析等方面的多相分类研究．该菌株具有拟诺卡氏属的典型特征，初步鉴定其为拟诺卡氏菌属的1个潜在新种．

产环己酰亚胺新菌株YIM41004的复合诱变选育

以云南大学教育部微生物资源重点实验室分离鉴定的产环己酰亚胺新菌株Streptomyces yunnanen-sisYIM41004为出发菌株,经紫外线(UV)、亚硝基胍(NTG)、UV+LiCl和60Co多重复合诱变,选育到1株生产特性和生长特性均有明显改善的变异菌株F8-439,环己酰亚胺产量由出发菌株的449.50 mg.L-1提高到539.32 mg.L-1,提高了19.98%.传代试验表明,该菌株连续传代8代,在遗传上是稳定的.