TNIP1真核表达载体的构建及表达

目的构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白3相互作用蛋白1(TNIP1)真核表达载体(p EGFP-N3-TNIP1),观察了解外源TNIP1蛋白的细胞内定位及其在He La细胞中的表达.方法应用RT-PCR从人外周血淋巴细胞中扩增TNIP1基因的开放阅读框(ORF),将目的片段亚克隆入p EGFP-N3中,筛选阳性克隆,提取质粒测序进行鉴定.将表达质粒转染He La细胞,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的表达与定位,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和蛋白质免疫印迹分别从m RNA水平和蛋白水平来检测TNIP1在He La细胞中的表达情况.MTT实验检测细胞增殖情况、流式细胞仪检测细胞周期.结果重组质粒双酶切鉴定,在1.9 kb左右有明显的条带,DNA测序结果证实重组质粒p EGFP-N3-TNIP1中含有的目的基因片段与Gen Bank上登录号为BC014008.1的TNIP1基因序列完全一致;荧光倒置显微镜观察重组质粒转染He La细胞后有绿色荧光蛋白的表达,转染48 h后通过q RT-PCR和Western blot分别检测到TNIP1m RNA和蛋白质的表达,均较对照明显升高,外源性的TNIP1蛋白主要定位于细胞质中.结论成功构建了p EGFP-N3-TNIP1真核表达载体,外源表达的TNIP1蛋白主要分布于He La细胞的细胞质部分,过表达TNIP1蛋白不影响He La细胞的细胞周期及细胞生长存活.

树鼩淋巴细胞的快速分离和分析方法的初步建立

本研究旨在建立树鼩淋巴细胞分离和培养的方法.根据组织来源,本实验分为3个实验组,第1组,采用树鼩活体改良心脏采血法并联合密度梯度离心法分离树鼩淋巴细胞;第2组,CO2处死树鼩,采用逆向解剖法游离其胫骨股骨制备骨髓细胞;第3组,直接获取脾脏细胞.上述3种方法收集过的淋巴细胞,经过12 h培养后,先用台盼蓝染色检测细胞的存活率,再应用流式细胞技术分析淋巴细胞的活力.结果显示3种方法所获取的树鼩淋巴细胞所占比例各异,具有组织特异性.0.5 mL的树鼩外周血可获得淋巴细胞大约为6.25×104个,占细胞总数的50%;双侧胫骨股骨可获得淋巴细胞大约为1.96×105个,占细胞总数的6.31%;树鼩脾脏可获得淋巴细胞大约为1.59×106个,占细胞总数的23.7%.各方法所获得细胞活力良好,且在流式细胞技术检测中可见明显分群.本研究初步建立快速分离和培养树鼩淋巴细胞的方法,为树鼩后续的淋巴细胞的免疫研究打下坚实的基础.