结核分枝杆菌低氧反应蛋白的原核表达及对巨噬细胞ANA-1功能的影响

目的原核表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)Rv2626c基因编码的低氧反应蛋白(hypoxic response protein 1, HRP1),并分析该蛋白对小鼠巨噬细胞ANA-1(简称ANA-1细胞)功能的影响及作用机理。方法将Rv2626c基因克隆至表达载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-Rv2626c,转入表达菌株BL21,诱导表达HRP1,经亲和层析法纯化和Western blot鉴定。使其作用于ANA-1细胞,用CCK8法检测ANA-1细胞的增殖活力,流式细胞术检测ANA-1细胞凋亡情况,Griess法及ELISA法分别检测一氧化氮(nitric oxide, NO)产生水平和肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)的分泌情况,同时采用核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)抑制剂Bay 11-7082、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)抑制剂U0126、SB 203580预处理ANA-1细胞后,检测NO、TNF-α、IL-1β变化情况。结果成功构建重组表达质粒pET-28a-Rv2626c,获得目的蛋白HRP1。与空白组相比,不同浓度的HRP1作用于ANA-1细胞后,细胞增殖活力未受抑制(P<0.05),凋亡率无明显差异,但培养细胞上清液中的NO、TNF-α及IL-1β含量均显著增加(P<0.05);若用Bay 11-7082及U0126预处理的ANA-1细胞,其NO及TNF-α的分泌量明显减少(P<0.001)。结论 HRP1对ANA-1细胞无细胞毒性,并可通过激活ANA-1细胞内NF-κB及MAPK信号通路促进其分泌具有抗菌效应的NO及TNF-α,增强其固有免疫效应,可作为结核疫苗候选优势抗原。