灯盏花CHI基因的再克隆及其绿色荧光蛋白表达载体构建

根据灯盏花转录组所注释的CHI unigene片段,设计了RACE相关引物,克隆到灯盏花CHI的cDNA全长序列,序列全长717bp,编码238个氨基酸.该氨基酸序列与我们前期所克隆的灯盏花CHI cDNA序列相比,在345、351位点发生了突变,碱基均由C突变为T,两个位点的突变均属于同义突变,编码的氨基酸分别为115、117位异亮氨酸、酪氨酸.同时将CHI基因片段插入到pDM 18-T,构建pDM 18-T-eBCHI中间载体.经测序验证后,根据pBI121-EGFP图谱,设计带有SalI、SpeI酶切位点的引物,以pDM 18-T-eBCHI中间载体为模板,扩增带酶切位点的CHI序列,扩增产物经回收、纯化后与双酶切的pBI121-EGFP链接,构建了重组表达载体pBI121-EGFP-CHI,CHI基因插入植物表达载体pBI121-EGFP的6xHis组氨酸标签与GFP基因间.经SalI、SpeI双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750bp的目的片段,通过进一步测序证明,CHI基因已成功地连接到pBI121-EGFP-eBCHI中.采用电击转化法将重组质粒导入根癌农杆菌GV3101,用叶盘法转化灯盏花叶片,筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和叶绿素荧光成像检测证明,重组基因已成功地转化到灯盏花愈伤组织中.为利用转基因技术研究CHI基因的表达及其亚细胞定位打下基础.

低氮胁迫灯盏花全植株的转录组文库构建及其测序

目的为探寻药用植物灯盏花Erigeron breviscapus的遗传背景,利用低氮胁迫的灯盏花全植株构建了转录组文库,并利用新一代测序技术进行测序。方法采用改良异硫氰酸胍-CTAB法,提取低氮胁迫灯盏花植株及其对照植株的总RNA,经富集m RNA、打断、构建测序用c DNA文库。结果通过测序,低氮和正常样本分别获得3 587万条和2 582万条测序读长(raw reads),总数据量超过6 G,碱基错误率低于1%(Q20)的数据分别为98.37%和98.67%。经de novo组装,总共得到101、156条Unigene,平均读长768 bp,N50为1 290 bp,其中44.39%长度超过500 bp。101、156条Unigene中,58.86%在公共数据库中比对到相似序列,89.08%Unigene在Nr数据库比对到相似序列。得到灯盏花黄酮类合成途径中包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酰-4-羟化酶(C4H)、查耳酮合成酶(CHS)、查耳酮异构酶(CHI)、黄烷酮3-羟化酶(F3H)、类黄酮3′-羟化酶(F3′H)、花色素还原酶(ANS)等序列。结论灯盏花的转录组信息得到较好的保存,为下一步灯盏花遗传环境互作研究及分子辅助育种奠定基础。