牛环曲病毒云南株纤突蛋白基因分子特征及进化分析

【目的】了解牛环曲病毒(Bovine torovirus,BToV)在云南部分地区牛群中的流行及其S基因遗传进化情况。【方法】采集云南省内13个地区15个牛场不同年龄牛的粪便样品655份,利用RT-PCR方法检测BToV,并对其中6株BToV阳性样品进行S基因扩增、克隆、测序及遗传进化分析。【结果】RT-PCR检测结果显示,655份牛粪便样品检出71份BToV阳性,总阳性率为10.8%;其中腹泻样品阳性率为21.2%(59/278),非腹泻样品阳性率为3.2%(12/377);1周龄、1周龄~1月龄、1~6月龄和1岁及上样品的阳性率分别为15.0%(3/20)、17.7%(20/113)、14.0%(45/321)和1.5%(3/201)。相似性分析结果显示,6条BToV S基因序列相似性为96.0%~99.8%,且与原始毒株Breda1的相似性为94.7%~96.0%,与国内流行毒株的相似性为95.2%~99.7%。遗传进化分析结果显示,6条S基因均与原始毒株Breda1不在同一大分支,与国内四川、河南毒株及土耳其毒株形成一个大分支,表明云南省BToV毒株与目前国内流行毒株一致,亲缘关系近。氨基酸突变位点分析结果显示,S基因存在少量独特的氨基酸突变位点。重组分析结果显示,BTOV-China/YN03-2021、BTOV-China/YN01-2021和BTOV-China/YN06-2022为重组序列,其中重组序列BTOV-China/YN06-2022得分最高,重组区域为1438~1609 bp区间,主要亲本为BTOV-China/YN05-2021;重组序列BTOV-China/YN03-2021,重组区域位于1668~3569 bp区域,主要亲本为土耳其毒株BToV-HT2-TUR(MG957146.1);重组序列BTOV-China/YN01-2021,重组区域位于261~2552 bp,主要亲本为土耳其毒株BToV-HT2-TUR(MG957146.1)。基因选择压力分析结果显示,BToV S基因的进化方式主要以中性选择为主,但同时也存在净化选择和正向选择的压力影响。【结论】本研究揭示了BToV已存在于云南省部分地区牛群体中且防控形势较严峻,可为中国研究BToV流行病学和BToV S基因遗传进化关系提供参考,同时也为云南地区制定BToV感染的防控措施提供理论依据。

鸡新城疫病毒和鼻气管鸟杆菌混合感染的实验室诊断和序列分析

2022年10月云南省某鸡场鸡群发生呼吸系统疾病。为探究病因,对发病鸡采集组织样品进行呼吸系统疾病相关病原PCR检测,并对部分阳性样品进行基因序列分析。结果显示:采集的5份病鸡样品新城疫病毒、鼻气管鸟杆菌核酸均为阳性,其他病原均为阴性。阳性样品新城疫病毒F基因与2013年国内发现的KC844235、2005年美国发现的Y18898等毒株高度同源,同源性均达100%,属于GroupⅡ分支,为弱毒株;阳性样品鼻气管鸟杆菌16S rDNA序列与2019年国内大陆地区发现的MN023015、2007年台湾地区发现的DQ195253以及2020年波兰发现的MW298723等菌株均在同一个分支上,同源性为100%,属于GroupⅠ分支。结果表明:该鸡场存在新城疫病毒和鼻气管鸟杆菌的混合感染,且病原基因变异较小,混合感染可能加重了被感染鸡群病情。本研究为新城疫病毒、鼻气管鸟杆菌混合感染的防控提供了参考。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒云南株的分离鉴定及遗传变异分析

2018年云南省边境地区某猪场猪群出现高热等症状,部分猪只死亡。为确认发病原因,采集死亡猪只肺脏组织样品进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)RT-PCR检测,然后将阳性样品接种Marc-145细胞,连续传代3次后发现产生稳定的细胞病变效应(CPE)。经间接免疫荧光试验(IFA)、毒价测定及病毒全基因组测序,最终确定病原为PRRSV,将其命名为YNML-2018株,毒价测定为10-4.88 TCID50/0.1 mL。全基因组序列分析显示,YNML-2018毒株基因组全长15357 bp,包含8个开放阅读框(ORF),其中非结构蛋白2编码基因(NSP2)缺失90个碱基。病毒全基因组遗传进化分析显示,该毒株序列与国内分离的高致病性PRRSV同源性为95.3%~99.3%;其NSP2高变区序列与国内分离的高致病性PRRSV同源性为92.1%~97.8%;结构蛋白GP3、GP5氨基酸序列与国内分离的高致病性PRRSV毒株同源性分别为84.3%~99.6%和83.1%~99.0%。结果表明,YNML-2018株与近年来我国PRRSV流行株相比存在一定变异,但变异程度较低,仍与首次报道的高致病性毒株JXA1同属于亚群V。本研究为掌握云南省边境地区PRRSV流行毒株的遗传变异特征提供了技术支撑,并可为疫苗选用提供数据参考。

2019年云南省景洪市哨兵动物多种虫媒病毒的分离鉴定

本研究旨在了解云南省景洪市虫媒病毒的流行情况。2019年在景洪市勐罕镇设立了3头哨兵动物牛,定期采血进行虫媒病毒的分离与鉴定,共获得7株病毒分离物。经病毒核酸的RT-PCR鉴定,分离到2株血清型分别为6型和7型流行性出血热病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV),2株血清型分别为4型和5型的蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV),1株帕利亚血清群病毒(palyam serogroup virus,PALV)中的D’Aguilar virus(DAV)血清型病毒和2株未鉴定出的环状病毒。经病毒Seg-2、Seg-3序列ORF区的比对和进化分析显示,7株病毒的地域型均为Eastern型,与日本、澳大利亚和印度毒株具有最近的亲缘关系。3头哨兵动物的血液和血清,经病毒核酸及血清中和试验检测,证明3头动物均被相应的病毒感染。动物感染病毒后,血清中的特异性抗体迅速上升,3~4周后达最高点并能够在该水平维持较长时间,而血液中病毒核酸含量2~4周到达最高点后则呈迅速下降趋势。本研究报道了景洪虫媒病毒的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性,研究结果为进一步了解当地的牛虫媒病毒提供数据支撑,同时3头牛分离获得7株病毒,提示当地可能还存在更多种类的虫媒病毒。

猪流行性腹泻病毒的实验室检测方法和生产防控措施

近年来,猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)呈现出全球性的流行及暴发,发病率及病死率逐年升高,经济损失巨大,严重阻碍了养猪业的健康可持续发展。文章综述了国内外研究者近年来在猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的实验室检测方法以及生产防控措施等方面的研究进展,以期为研究者提供参考。

2022年云南省边境地区牛蓝舌病病毒及阿卡斑病毒抗体检测

为了解云南省边境地区牛蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)与阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)的流行与分布现状,2022年在云南省9个边境县(市)采集1 820份牛血清样本,应用c ELISA方法进行BTV与AKAV抗体检测,并对检测结果利用IBM SPSS Statistics 22、Excel 2007等软件进行区间、群间和时间的分类统计分析。结果显示:共检出BTV阳性样品1 207份,样品阳性率为66.32%(1 207/1 820);检出AKAV阳性样品350份,样品阳性率为32.17%(350/1 088)。各县(市、区)的BTV样品阳性率为43.50%~93.00%,AKAV为12.90%~50.00%,不同地区间的差异有统计学意义(P <0.01);黄牛和西门塔尔牛的BTV和AKAV抗体样品阳性率均高于水牛,入境牛BTV抗体阳性率显著高于本土牛,两组数据差异均有统计学意义(P <0.01);规模养殖场的BTV和AKAV抗体阳性率和散养户差异无统计学意义(P> 0.05);7-8月的BTV和AKAV抗体阳性率显著高于5-6月(P <0.01)。结果表明:BTV和AKAV在云南省边境地区已广泛存在,其感染有加重趋势;病原通过境外牛传入国内的风险不断增加,防控形势较为严峻。因此,云南省应继续加强边境地区BTV、AKAV等虫媒病毒的监控,并制定实施相应防控措施,以保障国内畜牧业健康发展。

2013—2022年云南地区猪肠病毒G型的分子流行病学调查

【目的】了解肠病毒G型(Enterovirus G,EV-G)在云南地区猪场中的流行状况及其分子特征,为云南地区EV-G的防控提供理论依据。【方法】根据EV-G的5′-非翻译区(UTR)保守区域设计引物,RT-PCR扩增监测2013-2022年云南地区猪临床腹泻样品的EV-G阳性率,从阳性样品来源的区域、猪群结构及类型分析EV-G在云南地区的感染情况。利用EV-G VP 1基因巢式PCR引物,通过RT-PCR扩增EV-G VP 1基因全序列;采用MegAlign软件分析EV-G云南株的VP1序列与EV-G的20个基因型标准株的相似性及关键氨基酸突变,采用Mega 7.0软件构建VP 1基因的遗传进化树,并通过Protean软件的Jameson-Wolf分析法对VP1蛋白进行抗原指数分析。【结果】云南地区2013-2022年收集的1941份临床样品EV-G总阳性率为19.42%(377/1941),其中大理(54.54%)、玉溪(45.45%)、红河(43.24%)猪群的EV-G感染阳性率明显高于云南其他地区;乳猪(25.19%)和保育猪(24.68%)2个年龄组的猪群阳性感染率高于其他猪群;肛拭子阳性样品的检出率(53.58%)高于肠道内容物(29.71%)及粪便(16.71%)样品。基于20株EV-G代表株VP 1基因序列相似性分析及遗传进化表明,17个云南株为EV-G1型,2株为EV-G6型,1株为EV-G17型。17个EV-G1基因型云南分离株VP1蛋白在第125-150、170-190位氨基酸处抗原指数活跃度显著增强,此区域同时存在多个亲水性氨基酸位点的突变,如P^(127) S、P^(143) S、G^( 146) R、P^( 188 )S。【结论】EV-G1、EV-G6和EV-G17等多种基因型在云南地区猪群中流行,以EV-G1型流行为主。EV-G1基因型云南分离株的VP1蛋白在第125-150、170-190位氨基酸处存在显著的抗原活跃度,可能介导EV-G1基因型毒株在云南的感染和流行。

我国新分离芒市病毒基因组特征与细胞感染特性研究

目的 获取我国新发现芒市病毒(Mangshi virus, MSV)基因组特征以及在细胞上的感染特性,为开展MSV进化与致病性方面研究奠定基础。方法 通过高通量测序技术获取MSV毒株V301/YNJH/2019全基因组序列,使用IQtree、RPD4与Simplot等软件进行系统发育树的构建与基因重配分析;测定病毒在白伊蚊细胞(C6/36)、非洲绿猴肾细胞(Vero)与仓鼠肾细胞细(BHK)上的增殖特性,通过血清中和试验调查当地牛羊上病毒的感染情况。结果 病毒基因组全长20 623 bp,由12节段的双链RNA(Seg-1至Seg-12)组成。序列分析显示V301/YNJH/2019为基因重配毒株,病毒的Seg-1与Seg-11与我国湖水沉积物中发现的MSV对应基因节段序列高度相似,而Seg-2至Seg-10以及Seg-12则与我国蚊上分离的MSV毒株具有最近的亲缘关系。病毒在C6/36与BHK细胞上可高效增殖并引起细胞明显的细胞病变,在Vero细胞上可低水平复制但不引起细胞病变。在芒市采集的20份羊血清样本中未检测到MSV的中和抗体,但在采集20份牛血清中检测到2份阳性样本,其中和抗体效价分别为1∶128与1∶54。结论 V301/YNJH/2019为基因重配毒株,病毒可感染C6/36、BHK与Vero细胞,在芒市牛群中检测到感染动物。

帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。

中国帕利亚姆血清群中山病毒的分离及全基因组序列分析

旨在获取中国帕利亚姆血清群中山病毒(Chuzan virus, CHUV)毒株的全基因组序列并分析其遗传特征。应用BHK-21、Vero、MDBK细胞对云南省江城县采集的152份健康黄牛血液样品盲传分离病毒,针对出现细胞病变样品,采用CHUV VP7蛋白基因片段进行RT-PCR扩增和测序,并对阳性样品进行全长扩增及高通量测序,获得的全基因组序列进行遗传进化分析。结果:1份血液样品可致BHK 21、Vero、MDBK细胞病变;病毒基因组为10节段的“3-3-3-1”带型;病毒基因全长18 914 bp,各基因节段长度在728 bp(Seg-10)~3 930 bp(Seg-1)之间,编码6 072个氨基酸残基,编码蛋白在211(NS3蛋白)~1 295(VP1蛋白)个氨基酸残基之间;通过对保守基因Seg-1,Seg-3、Seg-7的核苷酸系统发育分析,显示与中国本土CHUV亲缘关系最近,为98.17%~99.65%,形成一簇;变异基因Seg-2的核苷酸序列同样与中国本土CHUV毒株相似度最近,为98.76%~99.57%。本研究表明中国CHUV毒株的Seg-1、Seg-3和Seg-7形成了独特的地域型,为深入揭示我国CHUV的致病性和病原学特征提供了基础数据。

口蹄疫病毒通用型RT-RAA-LFD快速检测方法的建立

为建立一种操作简便、有效的口蹄疫病毒(FMDV)核酸通用型检测方法,以FMDV 3D基因为靶基因,设计标记引物及探针,建立了一种新的检测FMDV的反转录-重组酶介导链置换核酸扩增结合侧流层析试纸检测(RT-RAA-LFD)方法。该方法操作简便,耗时短,40℃35 min内即可完成检测,通过肉眼观察可判定结果;具有较好的覆盖面,能够检出我国O型、A型FMDV主要流行拓扑型病毒,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等其他猪病病原无交叉反应;对RNA标准品的最低检测限为10^(-7)拷贝/μL,敏感性较高。利用建立的FMDV RT-RAA-LFD方法对5份临床样品进行检测,其结果与RT-PCR结果一致。结果表明,本研究建立的FMDVRT-RAA-LFD方法具有快速、直观、特异强、重复性好等优点,适合在基层兽医防疫部门和养殖场推广应用。

云南牛血液标本中哺乳动物正呼肠孤病毒(YNSZ/V207/2017)的分离鉴定

目的掌握云南省动物病毒的多样性和传播风险。方法在云南省师宗县设立10头哨兵牛,定期采血接种细胞进行病毒分离。通过RT-PCR、电镜观察、高通量测序与血清中和试验进行分离病毒的鉴定、全基因组序列获取与流行病学调查。结果2017年从采集的哨兵牛血液样本中分离出2株蓝舌病病毒、3株帕利亚姆病毒、2株流行性出血病病毒和1株待鉴定病毒(YNSZ/V207/2017)。电镜下YNSZ/V207/2017病毒粒子直径约80 nm,呈二十面体对称;全基因组序列分析显示其为哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalian orthoreovirus,MRV)血清1型毒株(MRV-1),病毒的不同基因节段分别与人、白尾鹿、水貂、果子狸和棕蝠上分离MRV的序列相似度最高;血清中和试验表明当地牛、羊和猪中MRV-1的抗体阳性率分别为32.5%、20.0%和42.5%。结论在云南省牛血液标本中分离出1株MRV-1型毒株,该毒株可能为不同宿主来源的基因重配毒株,MRV-1在当地家畜中广泛流行。

2016-2020年云南省部分猪场猪繁殖与呼吸综合征免疫抗体检测分析

为了解2016年-2020年云南省部分地区猪场猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫情况,采集了云南省9个州市188个健康猪场的4179份血清样品,应用ELISA方法进行猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测,分析不同州市、不同年份的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性率。结果显示,4179份血清样品中,阳性样品2932份、阴性样品1247份,总体抗体阳性率为70.16%;2016-2018年云南省部分地区抗体阳性率分别为76.97%、76.32%、75.75%,达到我国农业农村部要求的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性率70%的标准;2019-2020年抗体阳性率分别为63.68%、56.50%,未达到农业农村部规定的标准。9个州市中,保山、楚雄、红河、普洱、版纳、玉溪的抗体阳性率分别为84.85%、70.75%、76.46%、80.67%、76.82%、81.39%,达到农业农村部规定标准;大理、昆明、曲靖抗体阳性率分别为61.89%、67.42%、57.88%,未达到农业部规定标准。结果表明,云南省部分地区总体猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性率呈现下降趋势,各州市抗体阳性率也存在差异性。为了降低猪繁殖与呼吸综合征疫情发生风险,建议定期做好猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学、病原学监测,优化猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫策略,制定更加科学合理的综合防控方案,从而进一步保障云南省生猪养殖业高质量发展。

2020年云南省鸡呼吸系统疫病病因分析

为了分析云南省2020年度鸡呼吸系统疫病病因,分别在昆明、红河、曲靖、大理、楚雄、昭通等地111个养鸡场采集疑似发生呼吸系统疫病鸡肺脏、脾脏、喉气管等组织混合样品111份。采用PCR检测方法对疑似样品进行副鸡禽杆菌、鸡毒支原体(MG)、滑液囊支原体(MS)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽流感病毒(AIV)、鼻气管鸟杆菌(ORT)等传染性疾病病原核酸检测,对部分核酸样品进行测序验证。结果表明,副鸡禽杆菌、MG、MS、NDV、IBV、ILTV、ATV、ORT的检测阳性率分别为18.92%(21/111)、10.81%(12/111)、5.41%(6/111)、4.50%(5/111)、2.70%(3/111)、39.64%(44/111)、9.00%(10/111)、18.92%(21/111);混合感染占32.43%(36/111),2种、3种和4种病原混合感染分别占18.92%(21/111)、11.71%(13/111)和1.80%(2/111)。由此可见,云南省2020年度鸡呼吸系统疾病由多种原因引起,其中以副鸡禽杆菌、ILTV、ORT为主。

血清6型流行性出血病病毒在我国云南的首次分离与鉴定

为对流行于我国云南省的流行性出血病病毒(EHDV)进行分离与鉴定,以掌握我国流行EHDV的遗传特征与感染特性,本研究将2012年8月采集于哨兵牛的EHDV核酸阳性血液接种BHK-21细胞以分离病毒;通过血清中和试验与分离病毒的Seg-2、Seg-3基因测序分析,确定病毒的血清型与遗传特征;采用C-ELISA和荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法对EHDV感染哨兵牛血清中的抗体水平与血液中病毒核酸进行动态监测。结果显示,经BHK-21细胞分离出一株EHDV(YNSZ/V003/2012),血清中和试验显示分离病毒属于EHDV-6型。病毒Seg-2、Seg-3基因序列分析显示YNSZ/V003/2012血清型为EHDV-6型,地域型为东方型,与日本EHDV-6亲缘关系最近。哨兵牛感染该病毒后,血清中的特异性抗体迅速上升,感染3周后抗体达最高点并能够在该水平维持较长时间,而血液中病毒核酸含量则呈迅速下降趋势,感染7周后已经检测不到病毒核酸。本研究首次报道了EHDV-6型病毒株在我国云南的分离、序列特征以及在动物中的感染特性,为进一步开展EHDV-6型的流行病学调查和致病性等相关研究奠定了基础。

猪瘟病毒云南毒株E2基因片段序列测定及分析

用RT_nPCR方法 ,选择猪瘟病毒 2 0 0 0年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析 ,并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示 ,云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90 % ;但与中国标准强毒石门株差异较大 ,其核苷酸及氨基酸同源性均小于 80 %。

1株分离自云南省师宗县库蠓的新型西藏环状病毒

西藏环状病毒(Tibet orbivirus, TIBOV)为环状病毒属的新成员,病毒于2009年首次从我国西藏墨脱县采集的圆斑按蚊中分离,目前,对该病毒的认识仍十分有限。本研究对1株分离自我国云南省师宗县库蠓的新型TIBOV毒株YNSZ/V290/2019进行了鉴定,结果表明,病毒可在C6/36与BHK-21细胞上引起明显的细胞病变,电镜下观察,病毒粒子呈球形,直径55~75 nm,具有环状病毒属病毒典型形态特征。电泳结果显示,病毒基因组为十节段双链RNA,呈现“3-3-3-1”的电泳带型特征。对环状病毒属病毒高度保守的基因节段及其编码蛋白(Seg-3/T2)的序列分析显示,YNSZ/V290/2019为TIBOV的成员,与其他TIBOV毒株的核酸与氨基酸序列相似度分别为80.90%~81.70%与97.20%~97.30%。对决定环状病毒属病毒血清型的基因节段及其编码蛋白(Seg-2/OC1)的序列分析显示,YNSZ/V290/2019与已知TIBOV毒株的核酸与氨基酸序列相似度分别为26.90%~30.60%与28.50%~33.20%,表明该毒株可能是一种新血清型的TIBOV。对采集于师宗县牧场的40份黄牛与68份山羊血清进行血清中和试验,结果显示,新型TIBOV在牛、羊的阳性率分别为22.50%与4.41%。新型TIOBV在我国的发现,丰富了我国虫媒病毒的研究,为深入研究我国TIBOV的分布、致病性、感染宿主范围与诊断试剂的开发提供了基础。

云南省师宗县蓝舌病病毒的分离及鉴定

为了解近年来云南省师宗县蓝舌病病毒流行情况，2012年在师宗县五龙乡建立了10头蓝舌病血清学阴性黄牛的监控动物群。从2012年5-10月，每周采血1次，11-12月，每月采血1次，采用C-ELISA进行血清学监测。8月开始动物血清学检测结果转阳性，至11月，监控动物全部转为阳性。用转阳前1周、转阳本周、转阳后2-13周的经处理的红细胞静脉接种鸡胚，收获鸡胚肝脏，用PBS悬浮捣碎的鸡胚肝脏，上清接种于C6/36细胞一代、BHK-21三代后，出现细胞病变（cytopathic effect, CPE）。采用RT-PCR方法，针对蓝舌病较为保守的血清型群特异片段VP7设计了2对引物，扩增其相应片段。结果显示，共分离到86份疑似分离物，其中67份疑似分离物细胞培养液上清经RT-PCR扩增，均扩增出1156 bp片段，初步确认为蓝舌病病毒。采用国际24个蓝舌病标准毒及24个标准阳性血清对86份疑似分离物及其对应血清进行细胞微量中和试验，67份毒株为蓝舌病病毒，与RT-PCR结果一致。通过对2份经中和试验定型为BTV-1、BTV-16分离株的VP2基因测序分析发现，BTV-1株序列与同型Y863（登录号：KC879616）参考毒株的同源性为92%，BTV-16株序列与登录号为AB686221的毒株同源性为99%。结果表明共分离到67株蓝舌病毒株，分离株主要为BTV-1、BTV-9、BTV-16三个血清型。

云南蓝舌病病毒1型毒株M6基因序列分析

为了解云南蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）1型M6基因流行株的遗传变异及其与国内外流行病毒的遗传进化关系,试验从细胞培养物中分别提取4株云南分离株BTV-1（Y863、SZ120169、6-12和7-12）RNA,用M6基因特异引物进行RT-PCR扩增和测序,采用生物信息学软件对获得的M6基因编码区序列进行核苷酸、氨基酸同源性比对及遗传进化分析。结果表明,分别获得4株云南分离株BTV-1 M6基因1 763bp序列;4株云南分离株BTV-1核苷酸同源性在95.2%-99.9%之间,氨基酸同源性在97.6%-99.8%之间,1979年师宗分离的Y863病毒毒株与2012年师宗（SZ120169）、2013年江城（6-12、7-12）分离的3株病毒毒株核苷酸同源性分别为95.5%、95.2%和95.2%,氨基酸同源性分别为97.6%、98.4%和98.2%,而近两年（2012、2013）分离病毒核苷酸和氨基酸同源性较高,分别在96.9%-99.9%和99.1%-99.8%之间;遗传进化分析发现,4株云南分离株BTV-1为Eastern基因群病毒,它们之间核苷酸和氨基酸同源性分别为95.2%-99.9%和97.6%-99.8%;进一步分析发现4株云南分离株BTV-1与希腊及澳大利亚BTV-1型毒株亲缘关系较近,核苷酸和氨基酸同源性分别为90.4%-95.6%和95.1%-99.1%,而与地中海国家（意大利、法国、阿尔及利亚、摩洛哥和突尼斯）和南非毒株关系较远,核苷酸和氨基酸同源性分别在83.8%和95.7%以下。4株云南分离株BTV-1属于Eastern基因群病毒,云南分离株BTV-1 M6基因在自然进化中发生遗传变异缓慢,该基因可以用来进行BTV-1基因群分布及毒株的地理区域来源相关的研究。

云南牟定狂犬病病毒株N基因和G基因序列分析

自英国引进3株荧光素标记的针对狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体,建立狂犬病直接免疫荧光诊断技术。根据已知狂犬病毒核蛋白和糖蛋白基因序列,参照已发表文献,设计合成4对PCR引物和2对克隆引物,以弱毒疫苗毒株为阳性对照,建立狂犬病RT-PCR及套式PCR诊断技术。自牟定采集发病犬脑组织样品15份,免疫荧光及PCR诊断结果均为阳性。对病毒N基因和G基因全序列经RT-PCR扩增,克隆至pMD18-T载体进行测序(登录号分别为:EU095330、EU253477),并与已知代表毒株对应序列进行比对及系统发育分析,结果表明:云南牟定狂犬病毒属于基因1型和血清1型毒株,与近年从广西、浙江、江苏、湖北等省分离的毒株遗传关系密切,在系统发育树中形成同一小分支并均属于亚组群Ⅱ毒株。