云南省临床病毒学重点实验室科研平台创新前行

经云南省科技厅批准,由云南省第一人民医院及昆明理工大学共建的“云南省临床病毒学重点实验室”于2020年正式授牌。平台拥有近2000平方米的科研场地,建立了P2级别病毒学实验室,具备对有潜在生物危险因子(病毒、细菌等)核酸检测及鉴定的闭环操作能力,实验室配有冷冻超速离心机、高分辨激光共聚焦显微镜及小动物活体成像系统等实验硬件及信息化管理软件,可开展分子生物学和细胞生物学实验等科研活动。

溶瘤呼肠孤病毒在肿瘤生物治疗中作用的研究进展

肿瘤生物治疗的重要性日渐获得各方关注,而溶瘤病毒疗法作为肿瘤免疫治疗的一个分支也已成为研究热点。呼肠孤病毒(ReoV)地缘分布广泛,因其天然对肿瘤细胞具有靶向性及人体感染后几乎无症状而被认为是理想的溶瘤病毒载体,目前被广泛应用于临床试验。肿瘤细胞常伴有RAS基因的过度表达,会抑制对病毒有拮抗作用的激酶表达,造成ReoV大量复制致使肿瘤细胞发生凋亡、坏死、自噬等直接溶瘤效应;此外,ReoV感染肿瘤细胞后释放的促炎性细胞因子和趋化因子逆转了TME的免疫抑制状态,可激活并招募固有免疫效应细胞杀死肿瘤细胞,并促进适应性抗肿瘤免疫反应的产生。另外,ReoV与放化疗、其他免疫制剂的联用可增强了肿瘤治疗的效果。本文从溶瘤ReoV的生物学特性方面,重点介绍了ReoV的基本特征与感染机制及ReoV的肿瘤嗜性;同时,总结了溶瘤ReoV的溶瘤机制,主要包括ReoV诱导程序性细胞死亡及ReoV诱导非程序性死亡;概括了溶瘤ReoV所诱导的抗肿瘤免疫反应,如溶瘤ReoV诱导的抗肿瘤固有免疫、溶瘤ReoV诱导的获得性抗肿瘤免疫等,并介绍了溶瘤ReoV联合用药的效果。随着溶瘤作用机制的探明及临床试验的开展,溶瘤ReoV在肿瘤的生物治疗中的应用将更为广阔。

荷载溶瘤病毒细胞载体的研究进展

溶瘤病毒的给药方式分瘤内注射和静脉注射。静脉注射溶瘤病毒可被免疫系统完全排除而不能发挥其抗肿瘤作用。应用具有淋巴细胞特性、干细胞特性、肿瘤细胞特性的细胞载体荷载并运输溶瘤病毒到达肿瘤部位发挥作用,可更好地发挥抗免疫/肿瘤效应。

重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+的构建及其杀瘤活性

目的在体外构建携带CCL5和SSTR2双基因的重组溶瘤痘病毒,并初步检测其溶瘤活性。方法利用基因工程策略,分步构建重组痘病毒真核表达质粒pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+;经同源重组痘病毒Western Reverse(WR)株和23轮筛选纯化后,获得纯化的重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+;经扩大培养及浓缩纯化后获得高滴度的重组溶瘤痘病毒,用ELISA和Western blot分别验证感染重组溶瘤痘病毒的HeLa细胞CCL5和SSTR2的表达变化;用CCK-8法检测了rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对两株肿瘤细胞系的杀伤活力。结果成功构建了重组痘病毒真核表达质粒pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+;经同源重组、筛选纯化和浓缩后,获得滴度为9.4×10^8 PFU/mL的重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+;ELISA和Western blot结果表明,HeLa细胞感染rVV-CCL5-SSTR2-Luc+后,其CCL5和SSTR2蛋白表达水平显著高于对照组rVV-Luc+(分别为P<0.05和P<0.01);CCK8结果表明,rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对人胚肾上皮细胞HEK293T杀伤活力极低,而rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对两株肿瘤细胞系的杀伤活力均随感染时间逐渐增强。并且rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对肿瘤细胞的杀伤活力较之对照组rVV-Luc+均显著升高(HCT116:感染48 h时P<0.05;Hela:感染48 h时P<0.05,72 h时P<0.01)。结论本研究成功构建并获得了纯化的重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+,并初步验证了其杀瘤活性,为开展后续体内外实验奠定了实验基础。

云南省乙型肝炎病毒B2基因亚型表达质粒的构建

HBV感染是严重的公共卫生问题，全球约20亿人感染过HBV，其中3．5亿人成为了CHB，15％～40％的HBV慢性感染者最终发展成为了肝硬化或肝细胞癌（hepatocellullar carcinoma，HCC）。中国累计有7亿人曾感染过HBV，有1．2亿人成为HBV携带者，每年约60万人死于HBV感染引起的相关疾病。

外泌体在肝细胞癌病理调节中的研究进展

外泌体是具有磷脂双分子层的细胞外小泡。近年研究显示,外泌体介导的蛋白质、DNA和各种形式的RNAs(如miRNA、lncRNA、circRNA和mRNA等)在肝细胞癌(HCC)的发生、发展进程中发挥重要调控作用。许多研究表明,外泌体通过携带信息在细胞间传递,参与了细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及免疫调节等过程,因此,外泌体及其携带的信息可能成为HCC诊断、治疗及预后的潜在生物标志物及治疗靶点,但其临床应用仍需大量研究验证。本文就外泌体参与HCC发生、转移、诊断和治疗的可能机制进行综述。

外泌体源miRNA在白血病发病机制中的作用

背景:外泌体是穿梭在细胞间的物质传递与信息交流载体,是活细胞分泌到胞外的一种膜包被的纳米级囊泡。外泌体携载有亲本细胞来源的核酸(DNA、m RNA、microRNA等)、蛋白质、脂质等生物大分子,经体液流动远距离调控靶细胞的功能。白血病是一类造血系统的恶性肿瘤,大部分患者难以治愈。已有研究表明,外泌体源miRNA受脂质保护不易被RNase水解,介导白血病细胞的浸润、转移等恶性生物学行为。目的:对外泌体源miRNA在白血病中的作用进行综述,为探索白血病的分子发病机制以及挖掘诊治靶点提供重要信息。方法:以"外泌体、白血病、miRNAs"为中文检索词,以"Exosome,Leukemia,miRNAs"为英文检索词,通过计算机检索PubMed数据库与万方医学网;检索时限:2003年11月至2018年5月,最终纳入48篇文献进行结果分析。结果与结论:外泌体源miRNA通过驯化造血微环境,使白血病细胞的存活、增殖和迁移浸润等恶性生物学行为得到加强。通过干预外泌体源miRNA的产生和释放,阻断受体细胞摄取外泌体源miRNA以及干涉其调控的靶基因等可能会拓展白血病的治疗理念。通过深入探讨外泌体源miRNA在白血病中的作用,为挖掘诊治靶点提供重要信息。

ALOX5、ALOX5AP基因多态性与髓系白血病易感性的关系

目的:探讨花生四烯5-脂氧合酶基因(arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)rs2029253,rs2228064和rs2228065位点以及5-脂氧合酶激活蛋白基因(5-lipoxygenase activating protein gene,ALOX5AP)rs10507391和rs4769874位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)与髓系白血病发病风险的相关性。方法:经医院伦理委员会批准、患者知情同意,选取150例髓系白血病患者为髓系白血病(ML)组,134例健康人群为对照组。提取基因组DNA,采用聚合酶链反应及限制性片段长度多态技术(PCR-RFLP)联合PCR产物直接测序法检测ALOX5、ALOX5AP基因5个位点的基因型。结果:ALOX5基因rs2029253位点在ML组和对照组中的A等位基因频率分别为43.0%和34.3%,而等位基因G的频率分别为57.0%、65.7%;基因型AA、AG和GG在ML组中的分布频率分别为32.2%,21.5%和46.3%,而在对照组中的分布频率分别为15.7%,37.3%和47.0%。基因型AA和等位基因A可能增加髓系白血病的发病风险(OR=2.26,95%CI:1.43-4.56,P<0.05;OR=1.44,95%CI:1.02-2.03,P<0.05);基因型AG与等位基因G可能降低对髓系白血病的易感性(OR=0.46,95%CI:0.27-0.78,P<0.01;OR=0.69,95%CI:0.50-0.98,P<0.05)。而ALOX5基因rs2228064、rs2228065位点多态性在ML组与对照组间的分布差异无统计学意义(P>0.05)。ALOX5AP基因rs10507391位点等位基因A在髓系白血病组和对照组中频率分布分别为30.7%和36.2%;基因型AA、AT和TT在ML组中分布频率分别为1.3%,58.7%和40.0%,在对照组中的分布频率分别为9.7%,53.0%和37.3%;基因型AA可能降低髓系白血病的发病风险(OR=0.13,95%CI:0.03-0.57,P<0.05);而ALOX5AP rs4769874位点基因型与等位基因分布频率在ML组与对照组间的分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论:ALOX5 rs2029253位点基因型AA、AG和等位基因A、G以及ALOX5AP rs4769874位点AA基因型与髓系白血病发病的遗传易感性相关。

联合应用RNA-seq和ATAC-seq寻找FOXQ1转录因子的下游靶基因

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是一种全球高发的恶性肿瘤,发病原因复杂且预后较差。近年来发现叉头框Q1(Forkhead box Q1,FOXQ1)基因作为一类核转录因子在结直肠癌中高表达,可控制下游基因转录活性。本实验拟探究CRC细胞中FOXQ1的转录调控功能并寻找其下游基因。方法:(1)构建低表达FOXQ1基因的稳定转染CRC细胞株;(2)应用RNA seq检测FOXQ1敲低前后表达量显著差异的基因;(3)应用转座酶可接近性核染色质区域测序分析(Assay for Trans posase-Accessible Chromatin using sequencing,ATAC seq)检测FOXQ1敲低前后细胞染色质易接近性的变化;(4)进一步对FOXQ1敲低前后的RNA seq和ATAC seq数据进行一系列生物信息学分析,寻找CRC中FOXQ1转录调控的潜在下游基因。结果:应用RNA seq筛选出了敲低FOXQ1后表达显著差异的基因EI24、TLR2、SMAD3,通过联合分析两细胞系的测序结果,发现FOXQ1基因敲低后,在DLD1和SW480两个细胞系中染色质易接近性均增强且表达量均上调的基因有61个,染色质易接近性均减弱且表达量均下调的基因有70个,且EI24、TLR2、SMAD3基因均位于重叠分析结果中,其中TLR2、SMAD3基因的染色质区域有明显变化,而EI24基因的染色质区域变化不明显。通过代谢通路分析找到了EI24、TLR2、SMAD3基因所富集的代谢通路。其中SMAD3、TLR2基因在炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)通路中显著富集。EI24基因在p53信号通路(p53 signaling pathway)通路中显著富集。结论:基于染色质易接近性的变化和转录水平的研究发现:敲低FOXQ1基因对CRC细胞系中染色质的开放情况有较大的影响,且影响FOXQ1转录调控的下游基因的表达。找到了FOXQ1敲低后在SW480、DLD1中均发生变化的基因,为丰富FOXQ1转录因子的下游调控网络提供了研究基础。

构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒

旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。

miR-30a与其靶基因在肝癌中的作用研究进展

miRNA-30a(miR-30a)在肝癌组织中表达水平显著下调,可能是肝癌发展过程中的肿瘤抑制因子。miR-30a通过调控靶基因的表达参与肝癌细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移以及自噬反应等一系列生理病理过程,从而发挥抑癌作用。本文就近年来miR-30a在肝癌中的靶基因及其调控分子机制做一综述。

2015~2018年玉溪市5岁以下儿童诺如病毒分子流行病学分析

诺如病毒(Norovirus,NoV)是5岁以下儿童暴发腹泻病例的主要病原。为了解局部地区5岁以下儿童诺如病毒的分子流行病学特点,并为诺如病毒胃肠炎的防控提供可靠依据,本研究2015~2018年在云南省玉溪市的哨点医院采集1017份5岁以下儿童腹泻粪便标本,采用RT-PCR检测诺如病毒,并对诺如病毒ORF1-ORF2连接区进行扩增,对其中的GⅡ型诺如病毒序列进行比对和系统进化分析。结果显示:1017份腹泻粪便标本中共检出诺如病毒79份,阳性检出率为7.77%,其中GⅠ占15.19%(12/79),GⅡ占84.81%(67/79)。79份诺如病毒标本中37份GⅡ型诺如病毒测序成功,结果显示,GⅡ.4 Sydney[P31](36.71%,n=29)是主要基因型,其次是GⅡ.3[P12](6.33%,n=5),其他型别包括GⅡ.6[P7](2.53%,n=2)和GⅡ.2[P16](1.27%,n=1)。2015~2018年云南省玉溪市儿童诺如病毒以GⅡ.4 Sydney[P31]基因型为主。

纯化痘病毒筛选的常用方法

痘病毒是自然界普遍存在的DNA病毒,能够高效表达外源基因,诱导较强的细胞免疫和体液免疫,受到基因治疗学者的广泛关注。痘病毒发生同源重组的概率较低,所以有效地筛选和纯化痘病毒十分重要。目前常用的筛选重组痘病毒方法有基于CRISPR进行筛选;根据报告基因GFP、LacZ、GPT等进行筛选;利用TK-和Brdu结合荧光进行筛选;利用药物抗性基因与荧光或显色基因融合,即可在药物筛选的同时观察荧光或显色基因表达情况。本文旨在对目前常用的痘病毒的筛选纯化方法进行综述。

戊型肝炎病毒与UBR2相互作用的初步研究

戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)是一种经肠道传播、严重危害人类健康的病毒性肝炎病原体。HEV不仅可以在肝脏中复制,还可以在肝外组织复制并导致组织损伤,如HEV可在男性生殖系统中复制并导致睾丸损伤,但其发病机制尚不明确。UBR2在生殖系统高表达,是男性减数分裂和精子形成的关键,但其与HEV的相互作用尚不清楚。本文以探究HEV与UBR2之间的相互作用关系为目的,通过构建真核表达载体、转染细胞,利用Western blot技术验证UBR2能否成功过表达。同时,在细胞中加入HEV病毒,并利用Western blot技术探究HEV对UBR2的影响。另外,在HEV感染的新西兰大白兔睾丸组织中,利用免疫荧光共定位技术观察HEV与UBR2的相互作用关系。上述实验成功构建了pEGFP-UBR2质粒,并在A549细胞和Huh 7.5.1细胞中过表达,发现在A549细胞系中,HEV对UBR2有抑制作用;在感染HEV的睾丸组织中发现高表达的UBR2与HEV ORF2衣壳蛋白能够共定位,提示了两者可能存在相互作用。这为深入研究HEV与UBR2的相互作用,以及HEV导致生殖系统损伤的致病机制奠定了基础。

工程化间充质干细胞抗肿瘤研究进展

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类来源广泛的成体多能干细胞,因其具有低免疫原性、易向受损组织归巢、有旁分泌效应与免疫调节能力以及易于工程化操作等特点,在肿瘤治疗中具有一定优势。尽管目前在肿瘤治疗中应用MSCs存在争议,但已观察到过表达抗肿瘤基因(自杀基因、肿瘤坏死因子、白介素和干扰素等)或荷载溶瘤病毒、纳米颗粒、抗癌药物等经工程化改造和修饰的MSCs及其胞外囊泡能主动归巢到肿瘤组织,发挥抗肿瘤作用。目前已有工程化MSCs应用于复发性多形性胶质母细胞瘤的临床研究。因而概述MSCs特性以及工程化MSCs靶向肿瘤细胞和/或微环境的治疗研究,以期为MSCs临床转化及肿瘤治疗拓展新视野。

人脐带间充质干细胞对异体人外周血单个核细胞的免疫调节作用

目的探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSCs)对异体人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)增殖及其调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)亚群的影响。方法用组织块贴壁法培养原代hUC-MSCs,经消化酶传代培养扩增细胞,获得第4代hUC-MSCs;经Ficoll密度梯度离心法获取PBMCs。将hUC-MSCs与PBMCs以1∶5和1∶10的比例共培养,设单独培养的PBMCs为对照组,在培养体系中添加25 ng/mL植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA),培养5 d;采用全自动血液分析仪检测PHA活化PBMCs数量,流式细胞仪检测CD4^(+)CD25^(+)CD127d^(dim/-)Treg细胞表达水平。结果hUC-MSCs为贴壁生长的梭形细胞,具有分化为成脂肪样细胞、成骨样细胞和成软骨样细胞的潜能。hUC-MSCs与PBMCs以1∶5和1∶10比例共培养5 d,悬浮细胞数均少于单独培养组,hUC-MSCs抑制PBMCs增殖率分别为(81.54±5.10)%和(43.37±3.35)%;hUC-MSCs促进CD4^(+)CD25^(+)CD127d^(dim/-)Treg细胞亚群增殖,上调效率分别为(41.73±4.66)%和(19.39±5.62)%,高于单独培养组。结论hUC-MSCs在体外对PHA活化的异体人PBMCs有免疫负调节作用。

MiR-22与其靶基因在肝癌中的作用和机制

肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最具侵袭性的癌症之一,目前仍缺乏有效的治疗方法。MiR-22是肝癌发展过程中的肿瘤抑制因子,在肝癌组织中表达水平下调。MiR-22通过调控靶基因的表达以参与肝癌细胞的增殖、凋亡、浸润、转移以及免疫反应等一系列生理过程,发挥抑癌作用。MiR-22既可以作为肝癌的诊断标记物,也可以作为治疗的靶点。本文就近年来在肝癌中发现的miR-22的靶基因及miR-22影响肝癌增殖、凋亡、迁移、侵袭以及免疫等各种生理过程可能的分子机制作一综述。

急性髓系白血病巨噬细胞移动抑制因子表达及其对骨髓间充质干细胞白细胞介素8表达的影响

目的探讨急性髓系白血病(AML)患者骨髓液、外周血中巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的表达水平及其对骨髓间充质干细胞(BM-MSC)白细胞介素8(IL-8)表达的影响。方法收集2017年10月至2019年1月于云南省第一人民医院确诊的50例AML患者的骨髓液、外周血各50份,其中初诊17例、完全缓解(CR)26例、部分缓解(PR)+未缓解(NR)7例;取50名健康体检者的血浆、50例缺铁性贫血患者的骨髓液各50份作为对照组。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MIF蛋白在各样本中的水平,分析AML患者MIF表达水平与临床病理特征的关系。从42份AML患者骨髓液样本成功分离培养BM-MSC,选取其中适合的样本进行实验,分为BM-MSC对照组(未处理的BM-MSC)、重组人巨噬细胞移动抑制因子(rhMIF)组、rhMIF+ISO-1组,用ELISA和实时荧光定量聚合酶链反应分别检测IL-8蛋白和mRNA在各组BM-MSC中的表达水平。结果AML组骨髓液、血浆中的MIF蛋白表达水平分别为(24.9±7.7)ng/ml和(60.5±12.1)ng/ml,对照组分别为(5.3±2.6)ng/ml和(2.0±1.1)ng/ml,两组骨髓液间、血浆间及AML组骨髓液与血浆间比较,差异均有统计学意义(t值分别为136.71、33.97、17.58,均P<0.01);AML患者初诊组、PR+NR组骨髓液和血浆中MIF蛋白表达水平均高于CR组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。年龄≥60岁、外周血白细胞计数≥30×109/L、骨髓原始粒细胞比例>0.50患者骨髓液和血浆中MIF蛋白表达水平均升高(均P<0.05),而不同性别患者间二者差异均无统计学意义(均P>0.05)。各组BM-MSC检测结果显示,在基因和蛋白水平,rhMIF均促进BM-MSC表达IL-8,该过程可被MIF抑制剂ISO-1抑制(均P<0.01)。结论MIF在AML患者骨髓液、血浆中的表达水平升高,且随疾病进展而升高;rhMIF可促进BM-MSC表达IL-8。

YRNA:在癌症与非癌症中的研究进展

YRNA是40年前发现的一类高度保守的小分子非编码RNA,但它们的功能仍在调查中。新的研究表明,YRNA为人类细胞核中染色体DNA复制的重要因素。随着测序技术的发展,越来越多的研究提供更多关于YRNA的信息。本文综述了YRNA分子的类型、总结了YRNA分子的生物学功能,介绍了YRNA和YRNA衍生的小RNA(YRNA-derived small RNAs,YsRNAs)的研究现状,以及在包括肿瘤在内的若干疾病发生过程中的作用和潜在意义,并提出了未来研究的新视角,为YRNA的研究提供参考。