体细胞克隆技术在乌金猪遗传资源保护上的应用

旨在通过猪体细胞克隆技术,生产乌金猪火毛系,并分析生长发育能力及繁殖性能,为该技术在地方优良猪种保种上的应用提供理论依据。本研究采集了符合乌金猪种质特征的3头公猪和12头母猪的耳组织样品。公猪年龄分别为3、6、11月龄,母猪年龄差距较大,最小的2月龄,最大的10岁。其中3头母猪和1头3月龄公猪已被去势,10岁母猪已无繁殖能力。结果,成功建立了15头乌金猪的耳组织成纤维细胞系,分别选择1头3月龄乌金猪(♂)和10岁乌金猪(♀)的成纤维细胞进行体细胞核移植,经胚胎移植入16头代孕母猪,共获得25头克隆猪,克隆猪生长发育正常,性成熟后进行自然交配共获得39头F1代活仔。本研究通过体细胞克隆技术成功克隆了乌金猪,具备正常的生长发育性能和繁殖性能,为地方猪种的保护研究提供了新的途径。

通过微量细胞鉴定快速生产基因编辑猪

【目的】建立快速筛选猪的基因编辑阳性成纤维细胞系的方法以提高利用体细胞核移植产生基因编辑克隆猪的效率。【方法】通过PCR、T7EN1酶切和Sanger测序分析不同数量的已知猪基因编辑阳性细胞(20、50、100、150和200个细胞)的基因型,确定最小细胞数用于鉴定未知的基因编辑阳性细胞系以证明该方法的可行性。【结果】除20细胞组外,其他所有细胞组中均扩增出2条明显的T7EN1酶切条带(175和555 bp)。定量数据显示:20细胞组和50细胞组之间的条带灰度值存在极显著差异(P<0.01),因此50细胞可用于基因编辑阳性细胞系鉴定。利用CRISPR/Cas9系统构建IPO13打靶载体,转染猪胎儿成纤维细胞形成细胞克隆点后计数50个细胞来筛选阳性细胞系,再通过体细胞核移植快速生产了IPO13敲除猪,从而证实通过微量细胞鉴定快速生产基因编辑猪的可行性。筛选基因编辑阳性细胞系的一般方法大约需要33.7 d,新建立的方法细胞筛选周期仅为18.9 d(减少15 d),获得阳性细胞系的成功率也提高了约4倍。【结论】本研究建立了一种通过微量细胞鉴定快速生产基因编辑克隆猪的方法,该方法可行可靠。

p53^(V149F)突变打靶载体及细胞模型的构建

[目的]构建p53基因突变模型,为研究p53基因突变引发肿瘤的发生和进展提供细胞模型资源。[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,根据p53^(V149F)突变位点的序列,在线设计合成单链向导sgRNA,构建CRISPR打靶载体;将重组载体转染细胞,流式分选阳性细胞群,提取细胞基因组,Sanger测序分析Cas9核酸酶对靶位点的切割情况,构建同源修复模板,通过T7EN1试验进一步检测编辑效率;将重组载体和同源模板通过电转染方法共同转染至成纤维细胞中,通过单克隆挑取、PCR和Sanger测序鉴定挑取含目标突变的细胞株。[结果]成功构建靶向p53基因目标区域的CRISPR/Cas9打靶载体;获得5个含目标突变的克隆点,点突变率为10%,测序结果出现套峰,表明出现基因型多样化;1个细胞克隆的测序结果无杂峰,TA克隆鉴定结果表明:一个等位基因存在p53^(V149F)位点突变,另一个等位基因存在240 bp缺失。[结论]成功构建了含p53^(V149F)的细胞系,并对基因的功能进行了初步验证,为进一步构建两基因同时修饰模型奠定了基础,并为药物筛选提供可用的细胞模型资源,为创制模拟疾病发生的遗传模式和临床表现的小型猪实验动物模型奠定了基础。

猪GV/MⅡ期卵母细胞miRNAs表达谱及Npm2基因相关miRNAs筛选

旨在探索体外成熟前后猪卵母细胞miRNAs表达谱,并筛选参与调控Npm2基因表达的miRNAs。本试验回收屠宰场猪卵巢,收集GV期卵母细胞,经体外成熟培养后获得MⅡ期卵母细胞,分别提取约130个GV期和MⅡ期卵母细胞总RNA进行Illumina HiSeqTM 2500测序,获取miRNA测序数据,每个处理重复3次,筛选差异表达microRNAs并进行靶基因GO和KEGG聚类分析。结果表明,本研究成功构建了GV期和MⅡ期猪卵母细胞miRNAs表达谱,GV期和MⅡ期卵母细胞差异表达miRNAs有95个,具有相似表达模式的miRNA聚为一类,对95个差异表达miRNAs进行靶基因预测,共得到3 967个靶基因,经GO和KEGG富集分析表明,这些靶基因被富集于5 194个GO条目和212个信号通路,其中参与卵母细胞减数分裂成熟的信号通路有2个。在差异表达miRNAs中筛选到5个与Npm2基因相关的miRNAs。采用qRT-PCR对其中2个miRNAs进行验证,证实其表达趋势与测序结果一致。本研究筛选了GV期和MⅡ期卵母细胞差异表达miRNAs,推测差异表达的miRNAs可能通过代谢、卵母细胞减数分裂相关通路、孕激素介导的卵母细胞成熟通路等途径在卵母细胞体外成熟过程中发挥作用,并筛选出调控Npm2基因表达的miRNAs,研究结果可为进一步阐明miRNA对Npm2基因的调控及其在卵母细胞成熟过程中的作用提供依据。

Leptin过表达对猪前脂肪细胞脂滴形成的研究

研究Leptin过表达对猪前脂肪细胞脂滴形成的影响,旨为进一步研究Leptin与脂质代谢相关的分子机制奠定理论基础。选取Leptin过表达与野生型猪皮下脂肪组织,在无菌条件下分离前脂肪细胞进行传代培养并诱导分化形成脂滴,通过油红O和Bodipy染色后观察脂滴面积并分析脂质的含量,利用Q-PCR检测脂滴形成相关基因mRNA的表达水平。诱导4 d后可分化形成脂滴,油红O和Bodipy染色的结果显示,Leptin过表达猪前脂肪细胞脂滴数量和甘油三酯含量显著低于野生型(P<0.05);且脂质合成相关基因PPARγ、SCAP、SREPB1和PLIN2的表达水平显著低于野生型(P<0.01)。结果表明,过表达Leptin可促使猪前脂肪细胞中PPARγ、SREPB1、SCAP、PLIN2基因的表达下调,进而抑制脂滴形成。

绿茶有效活性成分EGCG诱导肿瘤细胞凋亡及其机制的研究进展

绿茶是亚洲及中东地区最流行的饮品之一,具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化、治疗心脑血管疾病、改善肥胖和糖尿病等活性。表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallo catechin-3-gallate,EGCG)是绿茶中含量最高的多酚类物质,具有抗肿瘤的功效。已知细胞凋亡是各种抗癌药物引发细胞死亡的主要方式,因此诱导癌细胞凋亡是治疗癌症的一个明确目标。大量研究报道了EGCG的抗肿瘤活性,并揭示了EGCG诱导肿瘤细胞凋亡的作用及机制,因此本文综述了近几年EGCG诱导肿瘤细胞凋亡的作用及机制,包括p53、STAT3、Akt、p38 MAPK、Wnt/β-catenin和TRAIL等与凋亡相关的途径,还综述了EGCG与天然产物、抗肿瘤药物及其它化合物协同诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制,并对EGCG的生物利用率、体内实验及临床实验的开展进行了展望,为EGCG的临床应用提供理论依据。

饥饿诱导三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的自噬应答观察

目的观察饥饿诱导三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的自噬应答情况,并探讨其相关分子机制。方法将MDA-MB-231细胞分为四组,对照组加入DMEM培养液正常培养;Baf-A1组在DMEM培养液中加入100 nM的Baf-A1;EBSS(饥饿)组加入EBSS培养液;EBSS+Baf-A1(自噬阻断)组在EBSS培养液中加入100 nM的Baf-A1,四组均处理8 h后,分别采用实时荧光定量法和Western blotting法检测各组微管相关蛋白轻链3(LC3B)、自噬相关蛋白7(ATG7)和自噬相关蛋白4A(ATG4A)的mRNA及蛋白。结果与对照组比较,EBSS组LC3B、ATG7 mRNA相对表达量升高,ATG4A mRNA相对表达量降低;与EBSS组比较,EBSS+Baf-A1组LC3B mRNA相对表达量升高、ATG7 mRNA相对表达量降低,与Baf-A1组对比,EBSS+Baf-A1组中LC3B mRNA相对表达量增加,ATG7和ATG4A mRNA相对表达量降低。与对照组比较,EBSS组LC3BⅡ/LC3BⅠ升高,ATG4A蛋白表达降低;与EBSS组比较,EBSS+Baf-A1组LC3BⅡ/LC3BⅠ增加,ATG7蛋白表达降低;与Baf-A1组相比,EBSS+Baf-A1组LC3BⅡ/LC3BⅠ增加,ATG7蛋白表达降低。结论EBSS处理的MDA-MB-231细胞自噬水平升高,细胞自噬体形成增多,在此过程中EBSS可能通过增加ATG7 mRNA的表达量增加细胞自噬水平。

自噬诱导、抑制的人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中ATG2A和ATG9A表达观察

目的观察自噬诱导、抑制的人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中ATG2A、ATG9A表达变化。方法人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231分为4组,对照组加入DMEM培养液正常培养,Baf-A1组在DMEM培养液中加100 nmol/L的巴弗洛霉素A1(Baf-A1)进行自噬阻断,EBSS组加入Earle's平衡盐溶液(EBSS)进行饥饿诱导细胞自噬,EBSS+Baf-A1组在EBSS培养液中加入100 nmol/L的Baf-A1,四组均培养4 h。采用实时荧光定量(Q-PCR)法检测各组细胞中ATG2A、ATG9A mRNA,采用WesternBlotting法检测各组细胞中ATG2A、ATG9A、P62、微管蛋白1轻链3(LC3)蛋白,计算LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ。结果与对照组、Baf-A1组相比,EBSS组、EBSS+Baf-A1组细胞中ATG2A、ATG9A mRNA相对表达量均显著升高(P均<0.05),且EBSS+Baf-A1组细胞中ATG9A mRNA相对表达量高于EBSS组(P均<0.05)。与对照组、Baf-A1组相比,EBSS组、EBSS+Baf-A1组细胞中ATG2A蛋白相对表达量均显著升高(P均<0.05);EBSS组细胞中ATG9A蛋白相对表达量均高于其余三组(P均<0.05);EBSS组细胞中P62蛋白相对表达量均低于其余三组(P均<0.05),EBSS+Baf-A1组P62蛋白相对表达量低于对照组(P均<0.05);EBSS组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ均低于其余三组(P均<0.05),EBSS+Baf-A1组LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ均高于其余三组(P均<0.05)。结论EBSS成功诱导MDA-MB-231细胞发生自噬,饥饿诱导的MDA-MB-231细胞自噬过程中ATG2A、ATG9A mRNA和蛋白表达升高。

饥饿诱导p53缺失猪成纤维细胞自噬促进凋亡

【目的】探究p53基因对饥饿诱导猪成纤维细胞(PFCs)形态、增殖、自噬及凋亡的影响,为进一步研究p53基因与肿瘤发生发展的分子机制提供理论依据。【方法】用EBSS、Baf A1和EBSS+Baf A1分别处理p53^(wt)和p53^(−/−)2株PFCs 2 h后,观察细胞形态变化并检测细胞的增殖、凋亡以及ATG9A和Bcl-2蛋白的表达情况。【结果】与对照组相比,EBSS和EBSS+Baf A1处理下p53^(wt)与p53^(−/−)的PFCs均发生皱缩和长出丝状伪足;在p53^(−/−)PFCs中,其细胞的增殖率明显下降,ATG9A蛋白的表达水平显著或极显著上调(P<0.05或P<0.01),Bcl-2蛋白的表达水平无显著变化(P>0.05);在p53^(wt) PFCs中,Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05);EBSS处理下,p53^(−/−)PFCs的凋亡比率显著升高(P<0.05)。与p53^(wt) PFCs相比,p53^(−/−)PFCs的形态变化率极显著下降(P<0.01),其细胞的增殖率显著升高(P<0.05),ATG9A蛋白表达水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01)。【结论】饥饿诱导p53缺失猪成纤维细胞自噬促进了凋亡的发生,这为进一步研究p53基因与自噬、凋亡及肿瘤发生的分子机制提供了重要的理论依据。

HT29和HCT116结直肠癌细胞增殖及其裸鼠移植成瘤研究

【目的】比较HT29和HCT116两株细胞系体外培养细胞增殖和在裸鼠体内移植后的成瘤情况。【方法】检测结直肠癌细胞HT29和HCT116的细胞活力,观察克隆形成细胞的形态,检测2株细胞p53和p21蛋白的表达水平;将2株细胞移植于裸鼠右侧腹股沟皮下,观察移植瘤的生长情况,记录裸鼠的体质量及移植瘤的体积。【结果】与HT29细胞相比,HCT116细胞在体外的增长率极显著升高(P<0.01),p21蛋白正常表达,p53蛋白表达水平极显著降低(P<0.01);在阿霉素存在的情况下,HCT116细胞中的p21蛋白表达水平极显著升高(P<0.01)。14 d内HCT116细胞移植量对裸鼠体质量无显著影响(P>0.05);单只细胞接种量为4×10^(5)和2×10^(6)个时,HT29细胞肿瘤体积显著高于HCT116细胞(P<0.05)。【结论】HCT116细胞在体外的增殖速率显著高于HT29细胞,但是在体内HT29细胞比HCT116细胞更易成瘤,其分子基础可能与HT29细胞中p53基因突变导致的p53蛋白高表达及其下游p21蛋白低表达有关;高浓度的癌细胞移植有利于肿瘤形成。本研究为结直肠癌动物模型的建立及其进一步研究奠定了基础。

日粮纤维调节猪生产性能及肠道健康的研究进展

日粮纤维是猪日粮中重要的组成成分。日粮纤维在维持猪的正常肠道形态、调节肠道菌群稳态、增强肠道免疫方面具有积极作用。文章综述日粮纤维对日粮营养物质表观消化率、猪生产性能及肠道健康的影响,为日粮纤维在养猪生产中的合理利用、开发富含纤维的非粮型饲料、发展"绿色、节粮、安全"的生猪养殖提供参考。