受体来源未成熟树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫低反应性的实验研究

目的研究不负载供者抗原的受者未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)对大鼠肝移植的保护作用,探讨imDC抑制排斥反应的机理。方法以SD大鼠作为供体,雄性Wistar大鼠作为受体,随机分为4组,每组10只,建立肝移植急性排斥反应模型,移植前对受体进行不同的处理。对照组:受体未接受任何处理;环孢素A(CsA)组:术后第2 d开始给予CsA〔10 mg/(kg.d)〕灌胃;成熟树突状细胞(mDC)组:受体术前1 d经阴茎背静脉注射受体来源的mDC 1×106个/只;imDC组:受体术前1 d经阴茎背静脉注射受体来源的imDC1×106个/只。模型建立后10 d各组随机处死5只,取移植肝脏组织行HE染色和免疫组化(FasL/Fas)染色,观察肝脏组织形态结构和排斥反应,根据Banff评分系统判断排斥反应程度;Western blot分析检测各组Foxp3编码的Scurfin蛋白的表达。另留5只大鼠观察术后存活时间;收集血标本,全自动生化分析仪测定ALT、TBIL;双抗体夹心ELISA法检测血清IL-2、IFNγ-、IL-4和IL-10水平。结果CsA组和imDC组术后大鼠中位生存时间明显长于对照组和mDC组,差异有统计学意义(P<0.05)。移植术后各组大鼠血清生化检查:对照组和mDC组ALT及TBIL明显高于CsA组和imDC组(P<0.05);且IL-2和IFNγ-也明显高于CsA组和imDC组(P<0.01),但IL-4和IL-10明显低于CsA组和imDC组(P<0.01)。移植肝脏形态学检测:对照组和mDC组与CsA组和imDC组比较,排斥反应更严重(P<0.05)。Western blot检测:imDC组Foxp3编码的Scurfin蛋白的表达明显高于其他3组(P<0.05)。结论imDC通过阻断间接识别能明显延长移植物存活时间。imDC可能通过以下机理诱导免疫低反应:诱导T细胞凋亡;选择性激活Th2细胞亚群,诱导Th1/Th2偏移;诱导调节性T细胞产生。

恒河猴肝移植模型急性排斥反应中白细胞介素6的表达

背景:白细胞介素6是免疫炎症反应中一种重要的细胞因子,它与移植排斥反应具有密切的关系,在移植排斥反应诊断和抗排斥疗效评价中发挥着重要作用。目的:检测白细胞介素6在恒河猴肝移植后急性排斥反应中的表达水平,以评价其作为肝移植后急性排斥反应早期诊断指标的价值。方法:以16只恒河猴为研究对象,将其随机分为实验组(围手术期不给予免疫抑制治疗)和对照组(围手术期给予免疫抑制治疗),然后建立恒河猴同种异体原位肝移植模型;分别在移植后6,12,24,72 h时间点收集血清及肝脏组织,通过检测肝功指标和移植肝组织苏木精-伊红染色Banff评分反映其移植排斥反应情况,并应用酶联免疫吸附法、免疫组织化学技术分别检测白细胞介素6的表达水平。结果与结论:肝移植后12,24,72 h实验组均有急性排斥反应发生,其中实验组丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素在24 h和72 h表达水平明显高于对照组(P<0.05);实验组72 h组织学表现重于对照组,Banff评分高于对照组(P<0.05);实验组中血清、肝组织的白细胞介素6水平在肝移植后12,24,72 h明显高于对照组(P<0.05),并以72 h最为明显。结果表明白细胞介素6可能参与肝移植后排斥反应的发生,其表达可能在恒河猴原位肝移植后急性排斥反应的早期诊断中有一定意义。

恒河猴肝移植急性排斥反应中核因子κBp65的表达

背景:核因子κB作为一种重要的核内转录因子,是多种信号转导途径的汇聚点,参与机体免疫细胞的增殖、分化及细胞凋亡等多种反应物质基因的表达调控,在体液和细胞免疫中发挥重要作用。目的:探讨恒河猴移植肝组织内核因子κBP65蛋白表达与急性排斥反应的关系。方法:将恒河猴随机分为2组:急性排斥反应组肝移植后不给予抗排斥处理,对照组肝移植过程中及移植后均给予抗排斥处理。分别在移植后6,12,24和72h4个时间点收集血标本,全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶、总胆红素,取移植肝脏组织行苏木精-伊红染色观察组织形态结构和排斥反应,根据Banff评分系统判断排斥反应程度,采用Western blot法检测肝脏组织中核因子κBp65的表达。结果与结论:肝移植急性排斥反应发生时肝功能变化滞后于肝组织病理学检查。当急性排斥反应发生时,移植肝组织中核因子κBp65表达上调,急性排斥反应程度也随之加剧。并且在急性排斥反应早期,肝功能、病理学仅有轻微改变时,核因子κBp65表达显著升高。因此移植肝组织中核因子κBp65表达水平的检测对移植后急性排斥反应的早期诊断有重要意义,同时核因子κB可能成为控制移植急性排斥反应的新靶点。

原位肝脏移植后胆道狭窄的病因分析与处理

背景:肝脏移植后胆道狭窄是严重影响肝移植后患者生存和生活质量的重要因素。目的:探讨和分析肝移植后胆道狭窄的病因及处理。设计、时间及地点:回顾性病例分析,于2006-05/2008-09在昆明医学院附属昆明市第一人民医院及云南省器官移植研究所肝移植研究中心完成。对象:90例临床肝脏移植患者,男67例,女23例,年龄2～68岁。供肝选择:尸体供肝72例,活体供肝18例,供受者ABO血型不合2例。方法:经典式原位肝脏移植1例,其余均为改良背驮式原位肝脏移植。胆道重建术中6例采用胆总管或右/左肝管(活体肝移植)空肠吻合术,84例胆总管-胆总管端端吻合术,其中5例供受体胆管不匹配者放置T型管。吻合采用可吸收缝线或6-0Proline线,前、后壁连续缝合。术后应用他克莫司胶囊、霉酚酸酯及皮质激素组成的三联免疫抑制方案预防排斥反应,逐步转为他克莫司胶囊、皮质激素二联方案。主要观察指标:患者术后胆道狭窄发生情况及病情转归。结果:90例肝移植患者中有8例发生胆道狭窄并发症,其中吻合口狭窄5例,非吻合口狭窄3例。吻合口狭窄中有3例炎性水肿引起狭窄者经逆行经胰肝胆管造影球囊扩张或置入胆道支架治疗后痊愈。2例因吻合口胆漏瘢痕收缩导致狭窄者经逆行经胰肝胆管造影置入胆道塑料支架,1例狭窄消失,1例好转;3例非吻合口狭窄者均为弥漫性肝内胆管狭窄者,经逆行经胰肝胆管造影或经皮肝胆管造影采用球囊扩张和胆道支架置入治疗,效果不佳,2例行二次肝脏移植后获救,1例无效死亡。结论:吻合口狭窄和非吻合口狭窄两种病因在治疗方式及结果中存在差异,故肝移植术后胆道狭窄的的鉴别尤为重要。只要从术前、术中、术后多途径、多措施全方位进行联合预防,严密监护,及时发现和采取适当的治疗措施,将有效地预防和减少肝移植术后胆道狭窄的发生,使患者长期存活。

恒河猴肝移植模型急性排斥反应时T细胞亚群的变化（英文）

背景:寻找肝移植急性排斥反应的早期诊断指标,可快速而有效的评估移植后排斥反应的风险,而T淋巴细胞在急性排斥反应中发挥主要作用。目的:观察恒河猴肝移植后血液T淋巴细胞亚群的变化与急性排斥反应的关系。方法:采用改良血管袖套+胆道支撑管+动脉吻合法建立16例稳定的恒河猴肝移植模型,并将模型随机分为2组:实验组围手术期不给予免疫抑制治疗,对照组围手术期给予免疫抑制治疗,分别在移植后6,12,24,72 h共4个时间点收集血标本和肝组织,全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素,用流式细胞仪检测血CD4+/CD8+水平,然后取移植后肝脏组织进行苏木精-伊红染色以观察肝脏组织形态结构的改变,并根据Banff评分系统判断排斥反应程度。结果与结论:实验组恒河猴肝移植后12,24,72 h均有急性排斥反应发生,其中实验组丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和总胆红素在移植后24,72 h表达水平明显高于对照组(P<0.05),实验组和对照组CD4+/CD8+的表达在移植后6 h即开始增高,实验组增高最明显,实验组移植后24,72 h CD4+/CD8+的表达明显高于对照组(P<0.05),实验组移植后72 h肝脏组织形态病理改变程度重于对照组,Banff评分高于对照组(P<0.05)。说明在肝移植后急性排斥反应早期,CD4+/CD8+的表达变化早于肝组织病理学及肝功能的改变。肝移植后血CD4+/CD8+水平的升高提示人体细胞免疫功能增强,对肝移植后急性排斥反应的早期诊断具重要意义。

恒河猴移植肝组织内细胞间黏附分子1与急性排斥反应的关系

背景:在急性排斥反应发生时会伴有移植组织中细胞间黏附分子1表达水平的增高。目的:探讨恒河猴移植肝组织内细胞间黏附分子1与急性排斥反应的关系。方法:建立恒河猴同种异体肝移植模型,随机分为实验组(移植后不给予抗排斥处理)和对照组(移植中及移植后均给予抗排斥处理)。结果与结论:实验组移植后24,72h血清丙氨酸氨基转移酶及血清总胆红素水平明显高于对照组(P<0.05或<0.001)。移植后12h实验组移植肝即表现为轻度急性排斥反应,说明急性排斥反应时肝功能变化滞后于肝组织病理学检查,移植后24,72h表现为中重度急性排斥反应。移植后6h实验组肝组织中血管内皮细胞、肝细胞膜、胆管上皮细胞上细胞间黏附分子1的表达呈持续增强,并显著高于对照组(P<0.05),随细胞间黏附分子1的表达增强,排斥反应加剧,说明在急性排斥反应早期,肝功能、病理学仅有轻微改变时,细胞间黏附分子1水平即显著升高。提示移植肝组织中细胞间黏附分子1表达的检测对肝移植后急性排斥反应的早期诊断具重要意义。

恒河猴肝移植模型移植后急性排斥反应时肿瘤坏死因子α的变化

背景:肿瘤坏死因子α是一种炎性细胞因子,参与移植免疫反应并增加移植物抗原表达,并在其中发挥着重要作用。目的:分析恒河猴肝移植后肝组织中肿瘤坏死因子α的变化与急性排斥反应的关系。方法:采用改良血管袖套+胆道支撑管+动脉吻合法建立稳定的恒河猴肝移植模型,将其随机分为实验组(围手术期不给予免疫抑制治疗)和对照组(围手术期给予免疫抑制治疗)。分别在移植后6,12,24和72 h 4个时间点分别收集血清及肝脏组织,检测肝功指标变化,通过苏木精-伊红染色Banff评分评定其移植排斥反应情况,并最终应用免疫组织化学技术、蛋白印迹分析分别检测肿瘤坏死因子α的表达水平。结果与结论:实验组和对照组肿瘤坏死因子α的表达在移植后6 h即开始增高,至12 h时达到高峰,24-72 h降低,并且实验组变化最明显。移植后6,12,24和72 h 4个时间点组实验组肿瘤坏死因子α蛋白表达明显高于对照组(P<0.05),此变化早于肝组织病理学及肝功能的改变。提示肝移植后肝组织肿瘤坏死因子α的表达水平变化,对肝移植后急性排斥反应的早期诊断具有重要意义。

肝移植术后门静脉血栓并闭塞的介入治疗

目的 探讨介入治疗肝移植术后门静脉血栓并闭塞的价值。方法 回顾性分析我中心2006年5月至2015年1月期间肝移植术后3例门静脉血栓导致门静脉闭塞并发症的介入治疗及其疗效。结果 3例患者术前发现门静脉轻微附壁血栓,Yerdel分级均为1级,移植术中未行血栓切除术,直接供/受体门静脉端-端吻合,术后8个月以后出现门静脉血栓并闭塞,均采用球囊扩张血管成形及自膨式支架植入治疗,介入治疗的技术成功率为100%。随访28--38个月,无并发症发生,移植物功能及患者生存情况均良好。结论 经皮血管内介入技术是治疗肝移植术后门静脉血栓并闭塞并发症的一种安全、有效的方法。

女性受者肝移植后早期妊娠并成功分娩一例

肝移植受者妊娠对母体和胎儿来说，均存在一定危险，这些一直是移植医师和产科医师关注的问题。2004年国内报道了首例肝移植术后妊娠、分娩的病例^[1]，近年来国内报道的女性受者妊娠均发生在肝移植术后19个月以上。我中心有1例女性受者在原位肝移植后第4个月受孕，妊娠39周后，顺产健康男婴1名，现报告如下。

原位肝脏移植术后胆道狭窄的病因分析与治疗方法

目的探讨原位肝移植术后胆道狭窄的病因及治疗方法。方法回顾性分析2006年5月至2008年9月间90例肝移植受者的临床资料，对术后发生胆道狭窄的病因和治疗方法进行了探讨。结果90例肝移植受者中，术后有8例发生胆道狭窄并发症（8．89％），其中吻合口狭窄5例，非吻合口狭窄3例。吻合口狭窄中，有3例因炎症水肿引起狭窄，经内镜逆行胆管造影（ERC）球囊扩张或置入胆道支架治疗后痊愈；另2例因吻合口胆漏疤痕收缩导致狭窄，经ERC置入胆道塑料支架，1例狭窄消失，1例好转。3例非吻合口狭窄者，均为弥漫性肝内胆管狭窄，经ERC或经皮肝穿刺胆道造影（PTC），采用球囊扩张和胆道支架置入治疗效果不佳，2例行二次肝脏移植后获救，1例治疗无效死亡。结论吻合口狭窄和非吻合口狭窄的病因对治疗的反应存在差异，因此，要重视肝移植术后胆道狭窄的病因诊断和分析。只要及时采取适当的治疗措施，均可有效地治疗肝移植术后胆道狭窄。

恒河猴肝移植术后急性排斥反应时肝组织中转化生长因子-β1的表达

目的检测转化生长因子(TGF)-β1在恒河猴肝移植术后急性排斥反应时肝组织中的表达水平,以评价其作为肝移植术后急性排斥反应早期诊断指标的价值。方法采用改良血管袖套+胆道支撑管+动脉吻合法建立稳定的恒河猴肝移植模型,将其随机分为实验组(围手术期不给予免疫抑制治疗)和对照组(围手术期给予免疫抑制治疗)。继而分别在肝移植术后6 h、12 h、24 h和72 h四个时间点分别收集血清及肝组织,通过肝功能指标检测及移植肝组织苏木精-伊红染色Banff评分评价其移植排斥反应情况,并应用免疫组织化学、Western blot法分别检测TGF-β1蛋白表达情况。结果 1 2组恒河猴肝移植术后12 h、24 h和72 h均有急性排斥反应发生,尤其肝移植后72 h时实验组肝组织急性排斥反应重于对照组,Banff分级水平高于对照组(P<0.05)。2 2组术后ALT、AST和TBIL水平均随着时间的延长呈上升趋势(P<0.05),在移植术后6 h和12 h时2组ALT、AST和TBIL水平比较差异无统计学意义(P>0.05);在移植术后24 h和72 h时实验组ALT、AST和TBIL水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。3免疫组织化学检测TGF-β1蛋白表达结果:实验组肝移植术后12 h后肝组织中TGF-β1免疫组织化学染色阳性面积百分率随着时间延长不断升高,且均明显高于对照组相应时相(P<0.05)。4 Western blot检测TGF-β1蛋白表达的半定量结果:实验组和对照组均在6 h即开始随着时间的延长呈现上调趋势,而实验组上调的幅度较对照组大,在6 h、12 h、24 h和72 h时实验组均分别明显高于对照组相应时相,差异有统计学意义(P值分别是0.003、0.001、0.001、0.001)。结论肝移植术后肝组织中TGF-β1水平升高提示机体细胞免疫功能增强,对肝移植术后急性排斥反应的早期诊断可能有一定意义。

大鼠半乳凝素9基因克隆及真核表达载体的构建

背景:研究提示,半乳凝素9在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控方面发挥作用,但其作用机制尚不明确。目的:克隆大鼠半乳凝素9基因片段,构建pDC316-GFP-Galectin-9真核表达质粒,以进一步了解半乳凝素9各种功能和反应机制,设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-11/2009-01在北京本元正阳基因技术有限公司完成。材料:SPF级雄性Lewis大鼠1只。方法:采用反转录聚合酶链反应技术,从大鼠肝脏组织中扩增出大鼠半乳凝素9基因片段,通过基因重组技术将该基因片段重组到pDC316-GFP真核表达载体上,构建pDC316-GFP-Galectin-9重组质粒,通过用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。主要观察指标:重组质粒的鉴定结果。结果:总RNA经RT-PCR扩增后,经琼脂糖凝胶电泳,在1kb下方可见一条明显扩增的条带,与预计的半乳凝素9-cDNA长度相符。重组质粒经NotⅠ/HindⅢ双酶切和未作酶切的重组质粒pDC316-GFP-Galectin-9一起经琼脂糖凝胶电泳,前者出现了980bp和5.8kb2条带(980bp为Galectin-9-cDNA产物,5.8kb为pDC316-GFP线状质粒),后者出现6.7kb条带(重组质粒pDC316-GFP-Galectin-9),初步表明重组质粒构建成功。测序结果用NCBI上的BLAST进行比对分析,其核酸序列与GeneBank中的半乳凝素9的mRNA的编码序列(NM_012977)同源性完全相符,进一步证实所克隆的基因为大鼠半乳凝素9-cDNA。结论:成功克隆了半乳凝素9基因并构建成其真核表达质粒。

恒河猴同种异体原位肝移模型的改进

目的探讨恒河猴原位肝移植模型建立的最佳方案。方法选用10对健康恒河猴进行同种异体肝移植,借鉴各种动物模型建立的方法 ,使用门静脉袖套法建立稳定的恒河猴原位肝移植模型。结果 10只恒河猴原位肝移植模型手术均成功。供体切取手术时间(20±5)min,供肝修整时间(30±7)min;受体手术时间(180±35)min,受体无肝期(17±4)min。术后24h存活者9只,1只术后9h死于腹腔内出血;72h存活者8只,于术后38h因消化道出血再死亡1只;1周存活5只,3只分别于术后9、11和11d死于排斥反应;最长存活32d者也死于排斥反应。所有受体均无门静脉血栓形成及胆道并发症发生。结论改进后的恒河猴同种异体原位肝移植模型具有操作简便、手术成功率高的优点,是肝移植临床前期研究较理想的动物模型。

腹腔镜肝切除术的体会（附6例临床报告）

目的 探讨腹腔镜肝切除术的适应证和可行性.方法 回顾分析5例病灶位于肝脏Ⅱ～Ⅵ段表面及边缘,1例病灶位于Ⅷ段表面的患者的临床资料.其中肝脏海绵状血管瘤4例,肝脏局灶性结节样增生2例,肝脏占位直径5～9.6 cm,平均（6.64±2.60）cm,6例肝功能Child评分均为A级.结果 6例均成功完成腹腔镜肝切除术,无中转开腹,其中局部切除术5例,左肝外叶切除术1例,手术时间为68～148 min,平均（105.17±27.97）min,术中出血80～650 mL,平均（247.50±90.91）mL,全部肝脏占位均完整切除,切缘均为正常肝组织;术后未发生胆漏和出血等并发症,恢复良好,术后平均住院（4.16±1.60）d.结论 位于肝脏表面、边缘的病灶行腹腔镜局部肝切除术和左外叶肝切除是安全可行的.

大鼠galectin-9基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的克隆大鼠galectin-9基因全长cDNA,构建含大鼠galectin-9基因的重组腺病毒载体,并予以鉴定。方法从大鼠的肝脏组织中用RT-PCR的方法克隆扩增大鼠galectin-9基因,再定向插入到带NotⅠ和HindⅢ酶切的pDC316-GFP穿梭质粒中,获得穿梭质粒pDC316-GFP-galectin-9。经PCR、NotⅠ和HindⅢ酶切及测序鉴定后,用脂质体将穿梭质粒pDC316-GFP-galectin-9与腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1.3Cre共转染HEK-293细胞。经位点特异性重组获得含目的基因的重组腺病毒Ad5-galectin-9,行PCR鉴定,经HEK-293细胞扩增及纯化制备高滴度病毒液,用细胞培养方法测定病毒TCID50滴度。结果 PCR、酶切及测序证实穿梭质粒构建正确,PCR鉴定证实大鼠galectin-9基因重组腺病毒载体构建正确,病毒的感染滴度为1.4×109U/ml。结论成功构建了含大鼠galectin-9基因的重组腺病毒表达载体,为进一步研究大鼠galectin-9基因的功能奠定了基础。