加快提升云南干细胞和再生医学领域科技创新能力

云南省干细胞和再生医学重点实验室原依托昆明医科大学分子临床医学研究院,2011年8月经云南省科技厅批准筹建,并于2013年12月正式挂牌。2022年6月21日,在昆明医科大学进行科研机构重组基础上,结合全校学科发展实际,学校正式发文将建设责任单位调整为科技成果孵化中心,以期进一步强化人才资源和平台资源高效整合,加快提升干细胞和再生医学领域的科学发现和原始创新能力,支撑学校重大科技突破,主动融入和服务国家和我省社会经济发展。

大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞的分离和培养

目的:体外培养大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞(NSCs),观察其生长及诱导分化培养特点。方法:取孕12.5~14.5 d的SD大鼠,采用机械分离法获取中脑腹侧组织,剪碎并吹打成单细胞悬液后,以2×10~5个细胞/ml的密度接种到无血清NSCs培养基中以神经球法培养。培养神经球5~7 d后,按原密度进行传代培养,并取第三代培养的神经球用含10%胎牛血清(FBS)分化培养液分化培养,分化培养7 d后行免疫细胞化学鉴定。结果:神经球呈巢蛋白(nestin)阳性,诱导分化后的细胞作分别呈微管蛋白(βIII-Tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性。结论:经神经球法培养得到的大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞可自我增值,并可诱导分化成神经元和胶质细胞。

不同胎龄小鼠脑组织中神经干细胞所占比例的研究

目的详细了解并比较不同胎龄小鼠全脑和大脑皮层组织中神经干细胞(neural stem cells,NSCs)所占比例,为后期优化分离培养NSCs提供直接量化数据。方法分离不同胎龄小鼠全脑(胎龄12.5、14、16和18d)和大脑皮层(胎龄14、16和18 d)组织,消化成单细胞悬液,贴壁培养3~4 h,细胞免疫荧光标记NSCs特异性标记物Nestin,统计分析各组中NSCs所占比例。另外,通过实时荧光定量PCR技术检测Nestin mRNA在不同胎龄(12.5、14、16和18 d)小鼠大脑皮层中的表达水平。结果细胞免疫荧光结果显示,分离培养的不同胎龄小鼠全脑和大脑皮层组织中均有Nestin阳性细胞。在分离培养的小鼠全脑组织中胎龄12.5 d组NSCs所占比例最高,为53.42%±1.57%;胎龄18 d组NSCs所占比例最低,为25.96%±1.31%,而胎龄14 d组和16 d组位于二者之间。在分离培养的不同胎龄小鼠大脑皮层组织中,胎龄14 d组NSCs所占比例最高,为33.65%±0.29%;胎龄18d组比例最低,为25.29%±0.28%,胎龄16 d组位于二者之间(26.82%±0.30%)。实时荧光定量PCR结果显示,当把胎龄12.5 d组的小鼠大脑皮层组织中Nestin mRNA表达水平设定为1,胎龄14 d组的小鼠大脑皮层组织中Nestin mRNA的相对表达量为0.83±0.04,胎龄16 d组为0.77±0.05,胎龄18 d组为0.44±0.05。因此,随着小鼠胎龄增加,小鼠大脑皮层中的Nestin mRNA的表达水平逐渐下降。结论在小鼠大脑发育过程中,随着胎龄增加,分离培养的小鼠全脑和大脑皮层组织中神经干细胞比例逐渐降低。

人参皂苷Rg3对体外培养小鼠神经干细胞分化的影响

背景:神经干细胞来源非常有限,而且在自然分化过程中绝大多数分化为神经胶质细胞,分化为神经元的比例相对较少,因此采取有效措施诱导其向合适的子细胞方向分化是非常重要的科研课题。以往研究证明人参皂苷类成分,如Rb1和Rg1,对神经干细胞的定向分化有一定影响,但Rg3是否对神经干细胞的分化起作用鲜有报道。目的:研究人参皂苷Rg3对小鼠神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞的影响。方法:分离孕14 d的C57BL/6小鼠的胎鼠大脑皮质神经干细胞并传代培养,用神经干细胞特异性免疫抗体Nestin和Sox2检测神经干细胞纯度。用分化培养基联合人参皂苷Rg3(空白对照、50 nmol/L和250 nmol/L)诱导神经干细胞分化3 d,然后用神经元特异性免疫抗体Tuj1和星形胶质细胞特异性免疫抗体GFAP检测神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞的情况,计算Tuj1^+/DAPI和GFAP^+/DAPI的比例;通过实时荧光定量PCR技术检测各组细胞Tuj1和GFAP mRNA的表达水平。结果与结论:(1)经细胞免疫荧光实验检测传代培养的小鼠胎鼠细胞几乎全为Nestin和Sox2双阳性细胞,表明成功分离培养出纯度较高的神经干细胞,可以用于后期实验;(2)诱导分化3 d后,与空白对照组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组相比,50 nmol/L人参皂苷Rg3组对神经干细胞分化为神经元具有明显促进作用(P<0.01),而空白对照组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组之间差异无显著性意义(P>0.05);(3)诱导分化3 d后,与空白对照组相比,50 nmol/L人参皂苷Rg3组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组对神经干细胞分化为星形胶质细胞具有促进作用(P<0.05),而50 nmol/L人参皂苷Rg3组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组之间差异不明显(P>0.05);(4)real time PCR结果总体与细胞免疫荧光结果相似;(5)结果表明,人参皂苷Rg3在50 nmol/L浓度时能明显促进神经干细胞向神经元和星形胶质细胞方向分化;但在250 nmol/L浓度时主要促进其向星形胶质细胞方向分化,对神经元分化没有显著影响。

人参皂苷Rg3对体外培养小鼠神经干细胞增殖的影响

目的研究人参皂苷Rg3对体外培养小鼠神经干细胞(NSCs)增殖的影响.方法分离培养胎鼠NSCs,使用神经球悬浮培养法传代,特异性抗体Nestin和Sox2鉴定NSCs.采用Brd U标记法和CCK-8法检测不同浓度Rg3(20 n M、50 n M、250 n M和500 n M)对NSCs增殖的影响.结果传代2次后的神经球几乎全为Nestin/Sox2免疫荧光双阳性细胞,表明其为纯度较高的NSCs.Brd U标记法表明与对照组、20 n M组、250 n M组和500 n M组相比,50 n MRg3组Brd U阳性细胞相对比率最高,差异有统计学意义(P<0.01),但其他各组之间差异无统计学意义(P>0.05).CCK-8法检测,结果显示50 n M Rg3在450 nm处吸光值最高,且与对照组(P<0.01)、20 n M组(P<0.05)和500 n M组相比,差异有统计学意义(P<0.01),但其他各组之间无统计学差异(P>0.05).结论人参皂苷Rg3能促进体外培养小鼠NSCs的增殖,且其最佳浓度是50 n M.

内源性神经干细胞治疗多发性硬化的研究进展

多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统(central nervous system,CNS)脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫性疾病。髓鞘再生失败和轴突损害是MS患者遗留永久神经功能损害的病理基础,如何促进少突胶质细胞的再生以重建髓鞘的结构和功能并实现患者功能性恢复是迄今为止尚未解决的医学难题。在过去数十年中发现,具有自我更新和多向分化潜能的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)在成年中枢神经系统中分布广泛,不仅参与神经组织稳态的维持,且能够响应脱髓鞘损伤而增殖、迁移至损伤区域分化产生髓鞘化少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)以参与髓鞘再生修复。故激活诱导内源性神经干细胞分化并参与髓鞘再生,从而修复MS神经损伤并实现功能性恢复,同时避免了免疫排斥及一系列伦理道德问题,在治疗脱髓鞘疾病以及中枢神经系统损伤方面将会有广阔的临床应用前景。

诱导性多能干细胞在多发性硬化中的研究现状

多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种常见的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病,好发于中青年,是成人神经性致残的主要原因。因其有较高的发病率、慢性病程和青壮年易患而备受关注。目前MS尚无有效的根治疗法,临床上仍以疾病修正治疗为主。因此探索新的治疗方法尤为重要。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)具有干细胞的分化全能性,不仅成功避开了胚胎干细胞的伦理问题,同时也解决了干细胞来源受限的问题,有望成为MS的良好治疗方式。

肝细胞癌相关差异基因的生物信息学及预后分析

肝细胞癌是全球癌症相关死亡的主要原因,目前对肝细胞癌的发病机制研究尚不完善,探索肝细胞癌发生、发展相关的分子标志物及其预后具有重要意义。从GEO数据库获得肝细胞癌组织和非癌组织的基因表达阵列数据GSE84402,利用GEO2R筛选差异表达基因;采用DAVID数据库对差异基因进行GO富集分析和KEGG通路分析;通过STRING数据库和Cytoscape软件构建差异表达基因对应的蛋白质相互作用网络,并从网络中筛选出核心基因(hub genes);结合KM plotter数据库的临床信息对hub genes进行预后分析。结果显示:共得到1 307个差异表达基因,其中上调基因741个,下调基因566个,这些差异表达基因主要涉及细胞分裂、细胞周期、DNA复制及物质代谢等生物学过程及生物通路。通过GO、KEGG及蛋白质相互作用网络筛选出BUB1、BUB1B、CCNA2、CCNB1、CCNB2、CDC20、CDK1、MAD2L1、PLK1等9个hub genes,进一步分析发现hub genes均与细胞周期的调控相关,表明细胞周期的调控失常在肝细胞癌的发生、发展过程中具有重要作用。生存分析显示9个hub genes在肝细胞癌患者中均为表达上调的基因,且与患者预后不良相关,这为寻找肝细胞癌患者预后相关生物标志物的研究提供了线索。

泛素结合酶E2S在肝细胞肝癌中的表达及其与预后的关系

目的探讨泛素结合酶E2S(UBE2S)在肝细胞肝癌(HCC)中的表达及预后意义。方法利用Oncomine、GEPIA分析UBE2S在HCC组织中的表达情况,利用GEPIA分析UBE2S与HCC患者生存期的相关性,通过STRING工具分析UBE2S的蛋白相互作用网络。结果UBE2S mRNA在HCC组织中高表达,且与HCC预后呈负相关(P<0.001),UBE2S蛋白在HCC组织中的表达高于正常肝组织。结论UBE2S在HCC组织中高表达,其表达水平与肝癌的预后有明显关联。

基于数据挖掘分析KIF2C在肝细胞癌的表达及临床意义

目的:通过数据挖掘分析肝细胞癌中KIF2C基因的表达并探讨其临床意义。方法:使用Oncomine和GEPIA数据库分析KIF2C在肝细胞癌组织中的表达情况;通过GEPIA数据库进行KIF2C的表达程度与病理分级及肝细胞癌生存期的相关性分析;最后利用STRING数据库分析与KIF2C相互作用的蛋白。结果:通过Oncomine和GEPIA数据库分析显示,在mRNA水平上,KIF2C在肝细胞癌中显著高表达(P=0.000),表达水平与其预后为负相关(P=0.000),且肝癌病理分级越高,KIF2C表达水平越高。通过STRING数据库分析显示与KIF2C相关的蛋白有PLK1、AURKB、CENPA等。结论:通过对肿瘤基因数据库进行挖掘发现,KIF2C在肝细胞癌组织中明显高表达且与患者预后相关,为肝细胞癌的致病机制研究和抗肿瘤靶向治疗提供了理论支持。

芹黄素抑制小胶质细胞活化作用研究

目的探讨芹黄素对小胶质细胞活化的抑制作用。方法原代培养SD大鼠小胶质细胞,实验随机分为空白对照组、脂多糖组(LPS组)、LPS+芹黄素(10μM)组、LPS+芹黄素(20μM)组、LPS+芹黄素(50μM)组。MTT法检测芹黄素对小胶质细胞活性的影响;ELISA法检测IL-1、IL-10等炎症相关因子以及BDNF、PDNF等神经营养因子的表达;RTPCR、western blot检测炎症相关基因i NOS转录以及表达水平。结果 MTT检测结果表明,芹黄素对小胶质细胞活性无明显抑制。LPS刺激后,芹黄素预处理组IL-1等炎症因子表达水平明显低于单独LPS组(P<0.05);而芹黄素预处理组IL-10的表达则高于单独LPS组(P<0.01);与此同时,BDNF、PDNF等神经营养因子的分泌也有相同趋势(P<0.05)。芹黄素预处理组i NOS表达和转录水平也低于单独LPS组(P<0.05)。结论芹黄素可抑制活化状态小胶质细胞炎症因子以及炎症相关蛋白的表达,并可同时促进与神经元分化成熟相关神经营养因子的分泌。

《现代形态学实验技术应用》选修课培养本科生科研实验技能的效果评价

目的基于实验平台开设的"现代形态学实验技术应用"选修课,了解其培养本科生科研实验动手技能的效果,为学校实现科研资源向教学资源的转化,并最终形成大学生科研实验技能培养的有效模式提供参考。方法对参加"现代形态学实验技术应用选修课"的60名本科生进行问卷调查。调查内容主要包括课前课后本科生对教学体系评价,学生对选修课内容、授课教师、学习效果自我评分及实验课成绩。结果 87%以上的本科生认为培养了自身科研兴趣;100%的高年级学生,100%的实验、检验、影像专业同学愿意继续选择此类型选修课;83%以上本科生认为对做课题有帮助;几乎90%以上本科生认为提高了科研动手技能;课后学生对课程掌握程度、认为该课程比较有用人数与课前相比,差异有统计学意义(P<0.05);高年级(大三大四)同学学习效果自评分与低年级(大一大二)比,差异有统计学意义(P<0.05);女生实验课成绩(82.94±6.06)高于男生(77.39±8.95),成绩差异有统计学意义(P<0.05)。结论课后学生在科研兴趣、实验技能、理论背景知识方面都有显著提高;高年级同学比低年级同学对实践技能掌握得好;女生实验课成绩比男生高。

视神经损伤后JNK3、APP蛋白的表达变化对视网膜神经节细胞存活的影响

目的探讨视神经损伤后小鼠视网膜神经节细胞(RGCs)中JNK3、APP蛋白的表达变化及其对RGCs存活的影响.方法取成年APP野生型小鼠,采用钳夹法建立视神经损伤模型,应用免疫组织化学、Western blot法检测造模后视网膜神经节细胞中JNK3、APP蛋白的定位和定量表达变化,比较损伤7 d后APP基因敲除组及其同窝野生型小鼠RGCs的存活数变化.结果视神经损伤后,视网膜神经节细胞中JNK3定位于细胞浆,p-JNK则从细胞浆进入到细胞核中表达,APP定位于细胞膜、p-APP在轴突及细胞浆中均表达.同时,Western结果表明上述4种蛋白表达量在损伤1 d组比假手术组均升高(P<0.01).与APP野生型小鼠视网膜神经节细胞存活数(127.7±7.0)相比,APP基因敲除组小鼠视网膜神经节细胞存活数(147±7.0)明显增多(P<0.05).结论视神经损伤后,JNK3、APP蛋白的表达增多在视网膜神经节细胞的存活中发挥了一定的作用.

hsa-miR-126的靶基因预测及功能分析

目的检测hsa-miR-126在各个组织器官中的表达情况,通过生物信息学预测hsa-miR-126的靶基因,进一步分析其可能功能,为研究hsa-miR-126的功能和机制奠定基础.方法通过miRGator v3.0数据库查看hsa-miR-126在各个组织器官中的表达丰度情况;应用TargetScan、DIANA-microT-CDS及miRanda预测hsa-miR-126的靶基因;将预测所得靶基因和已证实的靶基因交集组成的基因集合分别进行功能富集分析(GO analysis)和信号转导通路富集分析,分析hsa-miR-126的可能功能.结果 hsa-miR-126在胃肠道,心脏,肾脏,肝胆系统,肺,干细胞,睾丸,胸腺,甲状腺,子宫中表达丰度较高;结合已被证实靶基因得到40个候选靶基因;靶基因主要参与细胞迁移调控以及腺体发育相关生物过程,涉及数个癌症通路和与癌症发生相关的信号通路,以及神经营养因子信号通路,ErbB信号通路,趋化因子信号通路和VEGF信号通路等.结论 hsa-miR-126预测的靶基因集合富集于多个生物学过程,与肿瘤和血管性疾病密切相关,生物信息预测结果为今后的研究奠定了基础.

静注利多卡因对行乳腺癌根治术患者术后镇痛的干预效果

目的评估静脉输注利多卡因在乳腺癌根治术患者中对术后镇痛的完善作用。方法选择乳腺癌根治术患者60例,ASA I^II级。按随机原则进行分组,分为利多卡因组(L组)和生理盐水对照组(C组)。L组于麻醉诱导前按1.5 mg/kg静脉单次注射利多卡因,随后以2 mg/(kg·h)的速度输注,持续至术毕;C组给予等容量的生理盐水。两组均采用丙泊酚和瑞芬太尼全凭静脉维持麻醉。记录两组患者手术时间,术中瑞芬太尼用量,苏醒时间,术后疼痛评分(VAS评分),PCIA按压次数,以及恶心、呕吐的发生率。结果L组的术中瑞芬太尼用量低于C组(P<0.05),术后2、6 h的VAS评分也低于C组(P<0.05),48 h的PCIA按压次数较C组明显减少(P<0.05),而恶心、呕吐发生率也显著下降(P<0.05)。结论静脉注射利多卡因可减少乳腺癌根治术患者术中的阿片类药物用量,改善术后镇痛效果,并减少术后不良反应。

BDNF转染神经干细胞可降低β-淀粉样蛋白对神经元的毒性

目的探讨神经干细胞（NSCs）转染脑源性神经生长因子（BDNF）后对β-淀粉样蛋白（Aβ）毒性作用的抵抗能力及机制。方法用脂质体介导法将BDNF基因转染到C57小鼠NSCs内．经荧光显微镜及ELISA检测转基因NSCs及其分化细胞基因表达情况。体外培养小鼠神经元，将其分成3组：a组为神经元组，b组为神经元与NSCs共培养组，c组为神经元与BDNF转基因NSCs共培养组；每组设2平行组。培养3d后，向其中一平行组加入AB。蛋白，作为d、e、f组。通过ELISA和Western blotting检验记录24h和48h后神经元生存率以及各组Aβ、总tau蛋白、磷酸化tau蛋白水平。结果BDNF转基因干细胞及其子代细胞均有BDNF表达并持续1．5周左右。以a组细胞存活率为参照．24h后d-f组细胞平均存活率分别是51．86％±0．03％、73．68％±0．04％、85．34％±0．01％：48h后d-f组细胞平均存活率分别是38．76％±0．01％、59．65％±0．04％、75．6l％±0．07％；其中d、e组细胞存活率明显低于其他各组，差异有统计意义（P〈0．05）。a-c组Aβ蛋白未能检测到，d-f组Aβ蛋白水平较高，组间差异不具有统计学意义（p〉0．05）。各组细胞总tau蛋白水平差异不具有统计学意义（P〉0．05）。各组磷酸化tau蛋白水平差异有统计学意义（P〈0．05），其中d、e组磷酸化tau蛋白水平显著高于其他各组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论BDNF转基因NSCs可以持续表达BDNF基因产物，降低Aβ对神经元的毒性作用，同时通过减少细胞内磷酸化tau蛋白的水平提高细胞存活率。

任务导向性训练对痉挛型偏瘫儿童上肢功能的效果

目的观察任务导向性双侧上肢训练对脑瘫痉挛型偏瘫型患儿上肢功能恢复的效果.方法 27例3~6岁的脑瘫痉挛型偏瘫患儿随机分为对照组(n=13)和治疗组(n=14)进行训练.对照组进行常规作业治疗,治疗组在对照组基础上增加任务导向性双侧上肢训练.治疗持续10周.治疗前后均采用Peabody运动发育量表-2(PDMS-2)及Upper Limb Physician’s Rating Scale,ULPRS进行疗效评估.结果 2组患儿经过治疗后,Peabody运动发育量表中的抓握功能和视觉-运动整合评分均较治疗前提高(P<0.05),实验组评分高于对照组(P<0.05),评分增加程度比较也具有统计学意义(P<0.05);2组患儿治疗后ULPRS评分均有提高(P<0.05),治疗组较对照组评分差异无统计学意义(P>0.05),评分增加程度差异无统计学意义(P>0.05).结论任务导向性双侧上肢训练能够促进偏瘫型脑瘫患儿偏瘫侧上肢及手功能的恢复.

不同分化时间对体外培养大脑皮层神经干细胞分化的影响

目的研究不同分化时间对体外单层贴壁培养的大脑皮层神经干细胞（NSCs）分化成星形胶质细胞和神经元的影响。方法（1）体外分离、培养胎鼠大脑皮层原代NSCs，采用细胞免疫荧光染色检测P2代神经球和吹散成单细胞的NSCs中巢蛋白、Sox2的表达；（21取P2代神经球吹散成单细胞，接种于圆玻片上培养过夜，次日更换诱导分化培养基，分别继续培养ld、3d、5d，采用细胞免疫荧光染色检测细胞神经胶质纤维酸性蛋白（GFAPl、Tuj1的表达，分析神经元突起的平均数量、平均最长长度和平均分枝水平；（31取接种于12孔细胞培养板上的NSCs分化样品，采用实时荧光定量PCR检测NSCs不同分化时间点巢蛋白、GFAP、TujlmRNA的表达。结果（11细胞免疫荧光染色检测显示神经球、单层贴壁培养细胞几乎均为巢蛋白和Sox2双阳性细胞，说明培养的细胞几乎全部是NSCs。（21分化3d组、分化5d组NSCs中GFAP’细胞比例高于分化ld组，分化5d组NSCs中Tuil’细胞比例高于分化1d组、分化3d组，差异均有统计学意义（P〈0．05）；分化3d组、分化5d组所分化神经元突起的平均数量、平均分枝水平均高于分化1d组，差异有统计学意义（氏0．051；分化1d组、分化3d组、分化5d组所分化神经元突起的平均最长长度依次增加，差异有统计学意义（P〈0．05）；（3）与分化1d组、分化3d组比较，分化5d组NSCs中巢蛋白mRNA的表达降低，GFAP、TujlmRNA的表达增加，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论随着分化时间的增加，体外单层贴壁培养的NSCs分化出的星形胶质细胞和神经元的数量增多，细胞形态变复杂，神经元突起也越来越成熟，巢蛋白mRNA的表达降低，GFAP和Tuj1 mRNA的表达上升。

MiRNAs在成体神经发生中的作用

成年哺乳动物大脑仍然能够产生新生神经元的发现点燃了一个新的研究领域——神经发生。目前认为研究成年后的神经发生对进一步了解大脑功能和衰老,脑肿瘤、神经系统退行性疾病的发病机制和治疗,中枢神经系统的损伤修复等均具有重要的意义。成体神经发生是一个复杂的多步骤过程,每个阶段都受细胞内在基因表达程序和细胞外微环境因素的精细调控。越来越多的证据表明miRNAs代表了一类转录后基因表达调控因子,是控制成体神经发生的基因调控网络的重要组成部分。

淀粉样前体蛋白在神经发生中的作用与阿尔茨海默病关系的研究进展

阿尔茨海默病,俗称老年痴呆,由德国外科医生Alzheimer首次发现,是一种进行性发展、致死性神经系统退行性疾病。该病是目前最常见的一种失智症(俗称痴呆症,Dementia),但这种失智不同于正常老化。迄今为止AD具体的发病机制仍未明确、也没有精准的早期筛查和诊断手段及有效控制病情的治疗方法。近年来大量研究证实成年哺乳动物的中枢神经系统终身存在着神经发生。这为脑损伤和神经系统变性疾病的治疗带来了希望。文章将对成年中枢神经系统神经发生的过程及参与AD病程的关键分子APP在神经发生方面的最新发现进行综述,以期为本领域或相关研究提供借鉴或参考。