非洲马瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

非洲马瘟病毒(AHSV)为双股RNA病毒,能感染所有马科动物。为建立一种AHSV快速检测方法,根据GenBank及作者所测AHSV 9个血清型VP7-ORF全长核苷酸序列,设计一对位于AHSV基因组S7片段的特异引物,然后进行荧光定量检测。经试验,证实该对引物对9种血清型的AHSV RNA均有特异性扩增,能检出特异荧光信号,而对与AHSV同属的蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血症病毒(EHDV)及正常马淋巴组织和阴性对照均无扩增,无有效荧光信号可检出。以国家外来动物疫病诊断实验室已构建好的AHSV 9型pMD18-T-VP7质粒为标准品可建立良好的标准曲线,实现对检测样本的实时定量。本研究建立了模板预变性结合"三步"法敏感特异的AHSV实时荧光定量RT-PCR快速检测方法,检测灵敏度可达102拷贝/μL。

非洲马瘟病毒TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立非洲马瘟病毒(AHSV)TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank及自己所测的AHSV 9个血清型VP7的ORF全长核苷酸序列,设计2套位于AHSV基因组S7片段的特异引物及相应TaqMan探针。经试验,结果证实2套引物探针可将9种血清型的AHSV RNA分为2群而分别进行特异性检测,而对与AHSV同属的蓝舌病病毒、鹿出血热病毒及正常马淋巴组织均无荧光信号可检出。其中探针H2及其配套引物可特异性检测AHSV1、3、4、6、7、8、9七个血清型,而MGB探针及其配套引物可特异性检测AHSV 2、5两个血清型。分别以构建好的2型、9型全长VP7的pMD18-T-VP7质粒为标准品建立标准曲线,最终建立了AHSV TaqMan荧光探针实时荧光定量RT-PCR快速检测方法,可实现对全部9个血清型AHSV的定量检测和快速诊断。