利用微卫星标记分析云南省10个山羊品种的遗传多样性

本研究应用微卫星标记技术,选取15个微卫星位点分析云南省10个地方山羊品种(弥勒红骨山羊、圭山山羊、马关无角山羊、师宗黑山羊、威信白山羊、龙陵黄山羊、罗平黄山羊、云岭山羊、宁蒗黑头山羊、昭通山羊)以及参照群波尔山羊的遗传多样性及遗传关系。结果表明:除MCM200外,其他14个微卫星位点均属于高度多态位点;11个群体观测杂合度值(0.573～0.692)、期望杂合度值(0.608～0.696)、平均多态信息含量(0.562～0.655)均大于0.5,表明群体遗传多样性丰富;群体间遗传变异系数为0.112,处于中等以下分化程度,群体近交系数均为正值(除马关无角山羊),表明云南省地方山羊品种内都存在不同程度的近交;群体间的基因流大于1,说明品种间存在着一定程度的基因交流;基于Nei氏遗传距离计算和UPGMA聚类分析,波尔山羊与10个云南地方山羊品种亲缘关系较远,单独为一支;10个云南地方山羊品种分为2个类群,弥勒红骨山羊、圭山山羊和马关无角山羊聚为一支,师宗黑山羊、威信白山羊、龙陵黄山羊、罗平黄山羊、云岭山羊、宁蒗黑头山羊、昭通山羊聚为一支。

云南地方绵羊品种遗传多样性分子评价

【目的】利用微卫星标记分析评价8个云南地方绵羊品种的遗传多样性,为资源保护和种质创新提供参考。【方法】提取迪庆绵羊、兰坪乌骨绵羊、宁蒗黑绵羊、石屏青绵羊、腾冲绵羊、昭通绵羊、丽江绵羊和云南半细毛羊这8个云南地方绵羊品种共465只绵羊的血样总DNA,利用10个微卫星标记对这些样本进行遗传多样性,UPGMA系统聚类和群体遗传结构分析。【结果】通过对8个绵羊群体的10个微卫星位点的分析,共发现469个基因型,160个等位基因,平均每个位点有16个等位基因。其中,在位点DYMS1、MAF214和OarFCB 304检测到的等位基因数最多,都为23个;在SRCRP5位点检测到的等位基因数最少,为7个。UPGMA系统聚类图表明,丽江绵羊和宁蒗黑绵羊的遗传距离最近;石屏青绵羊和云南半细毛羊的遗传距离最远。群体遗传结构分析结果显示,465个样本分别来自于8个种群,这与本研究中的绵羊群体来源于8个地方的群体相符。【结论】微卫星位点SRCRSP1、OarFCB304、OarJMP58、MAF33、DYMS1、ILSTS11、MAF214、MCM140和ILSTS28可以作为有效的遗传标记用于绵羊品种的遗传多样性和遗传关系研究。除石屏青绵羊变异最小,其余7个品种都具有较为丰富的遗传多样性,它们之间的遗传分化关系与品种的地域、起源、驯化和相互引种有关。

抗冻蛋白对山羊精子冷冻保护效果的分析

本实验系统评价了抗冻蛋白Ⅲ(AFPⅢ)对山羊精子的冷冻保护效果。采用假阴道法采集6只云南黑山羊精液,离心洗涤去除精浆后和冷冻稀释液(0、0.1、1、10、100μg/m L AFPⅢ)混合,经4℃平衡、液氮气相预冻后直接投入液氮保存。解冻后检测精子活力、顶体、质膜以及早期凋亡等指标。同时采用透射电镜(TEM)观察冷冻对精子超微结构的影响。结果表明:与对照组相比,AFPⅢ并不能显著改善山羊解冻后精子活力、顶体完整性、质膜完整性和低渗耐受性(P>0.05)。此外,AFPⅢ并不能抑制解冻后精子的磷脂酰丝氨酸(PS)外翻。电镜实验结果进一步证实,AFPⅢ并不能有效保护冷冻精子质膜。总之,本实验证实,AFPⅢ并不能降低山羊精子的冷冻损伤,相反其可能加重冷冻对精子质膜的损伤,其损伤机制尚需要进一步研究。

产气巴氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立产气巴氏杆菌(P.aerogenes)的快速检测方法,本研究根据P.aerogenes 16S rRNA基因的保守序列设计引物及TaqMan探针,并优化反应体系和反应条件,建立了P.aerogenes TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线结果显示,质粒标准品在4.7×10^(6)拷贝/μL~4.7×10^(1)拷贝/μL和Ct值之间的线性关系良好,相关系数R2为0.992,扩增效率为98.29%。利用建立的TaqMan荧光定量PCR方法对P.aerogenes、溶血性曼氏杆菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌等36种常见猪、牛、羊细菌病原检测均为阴性结果,特异性强;该方法对重组质粒标准品pMD19-PA的最低检测限为47拷贝/μL,敏感性高;该方法批内、批间重复性试验的变异系数在1.58%~2.55%,重复性好。利用建立的TaqMan荧光定量PCR和细菌分离方法对46份流产猪、牛和羊胎儿的样品进行P.aerogenes检测,结果显示前者的阳性检出率为23.91%(11/46),传统分离方法的阳性率为15.22%(7/46),两种方法总符合率为91.30%。本研究首次建立P.aerogenes的荧光定量PCR检测方法,为猪、牛和羊P.aerogenes的感染提供了敏感、快速和高通量检测方法。

白藜芦醇对绵羊冷冻精液质量的影响

试验旨在研究白藜芦醇对绵羊冷冻精液质量的改善效果。采用假阴道法采集6只云南半细毛羊精液,用含不同浓度(0、0.1、1、10、20μmol/L)白藜芦醇的Optidyl稀释液稀释后进行细管分装,低温平衡和液氮气相预冻后,在液氮中保存30 d。解冻后测定精子活力、质膜完整性、磷脂酰丝氨酸(PS)分布、顶体完整性和活性氧等指标。结果表明,解冻后10μmol/L白藜芦醇组精子总活力、直线运动百分率、精子弯尾率分别为76.14%±0.97%、43.56%±0.91%、43.24%±1.68%,均显著高于其他各组(P<0.05);而20μmol/L白藜芦醇组精子总活力、直线运动百分率、精子弯尾率分别为21.78%±0.79%、25.23%±1.34%、4.84%±0.68%,均显著低于其他各组(P<0.05)。10μmol/L白藜芦醇组精子顶体完整性最高,为50.47%±0.91%,显著高于其他各处理组(P<0.05)。PS分布结果表明,10μmol/L白藜芦醇组正常精子百分率为46.43%±2.95%,显著高于20μmol/L组(31.14%±3.56%,P<0.05),与其他各组无显著性差异(P>0.05)。20μmol/L白藜芦醇组PS标记率(39.82%±3.38%)显著高于其他处理组(P<0.05)。活性氧试验结果表明,10μmol/L白藜芦醇组正常精子(63.57%±0.71%)显著高于其他各组(P<0.05);而20μmol/L白藜芦醇组正常精子(32.45%±1.42%)显著低于其他各组(P<0.05)。综上,在冷冻稀释液中添加白藜芦醇可以改善绵羊冷冻精液品质,这与白藜芦醇的抗氧化特性有关。但是,白藜芦醇的冷冻保护效果具有明显的浓度依赖性,其最佳作用浓度为10μmol/L,过高浓度的白藜芦醇反而加重精子的冷冻损伤。此外,对于白藜芦醇对绵羊精子的抗冻保护效果仍然需要体外受精或人工授精验证。

白藜芦醇对山羊冷冻精液质量的影响

本实验旨在研究白藜芦醇对山羊冻精质量的改善效果。用假阴道法采集8只云上黑山羊精液,用添加不同浓度(0、0.1、1、10、20μmol/L)白藜芦醇的Optidyl稀释液稀释后进行细管分装,其中不添加白藜芦醇组为对照组。在5℃平衡4 h后,将细管于液氮蒸气中预冻,最后在液氮中保存1周。37℃水浴解冻后测定精子活力、顶体完整性、膜完整性和磷脂酰丝氨酸分布等指标。结果表明:与对照组相比,10μmol/L白藜芦醇冷冻组精子直线运动百分率和质膜完整性均提高(P<0.05);10μmol/L白藜芦醇抑制了冷冻解冻后精子ROS的产生(P<0.05);而20μmol/L白藜芦醇冷冻组精子解冻后直线运动百分率低于其他各处理组(P<0.05);白藜芦醇不能缓解冷冻解冻过程对精子总活力、顶体完整性和磷脂酰丝氨酸分布的不利影响。总之,冷冻稀释液中添加10μmol/L白藜芦醇可以改善山羊冻精质量,这可能与白藜芦醇的抗氧化特性有关;但过高浓度的白藜芦醇加重精子的冷冻损伤程度。白藜芦醇是否能提高山羊冻精的人工授精效果还有待进一步研究。

猪卵母细胞在GV期与MⅡ期的冷冻保存效果比较研究

为比较猪卵母细胞在GV期与MⅡ期的冷冻保存效果,试验在这两个成熟阶段对其进行玻璃化冷冻,GV期卵母细胞解冻后培养至成熟,MⅡ期卵母细胞解冻后恢复2h,然后采用免疫荧光标记、Western blotting和链霉蛋白酶溶解方法分别检测它们的皮质颗粒分布、CD9蛋白表达水平和透明带消化时间上的差异。结果表明,GV期卵母细胞在解冻后2h的存活率显著低于MⅡ期卵母细胞(P<0.05),但极体排出率与对照卵母细胞无明显差异(P>0.05);在冷冻MⅡ期卵母细胞中,皮质颗粒的皮质区分布比例和CD9的蛋白表达水平显著下降(P<0.05),但冷冻GV期卵母细胞经体外成熟后则无明显变化(P>0.05);冷冻GV期与MⅡ期卵母细胞均不会影响透明带的消化时间(P>0.05)。由此可见,猪卵母细胞在GV期的冷冻存活率虽然较MⅡ期低,但其体外成熟后极体排出率、皮质颗粒分布和CD9蛋白表达水平均未受到冷冻的影响。

迪庆藏猪ADFP基因多态性及其组织表达特征

【目的】从分子遗传学角度分析不同基因型迪庆藏猪群体不同组织中ADFP基因的表达差异,为迪庆藏猪的选育工作提供参考依据。【方法】利用PCR扩增测序方法对113头迪庆藏猪ADFP基因进行扩增测序,利用DNASTAR 5.0对序列进行比对分析及多态性位点(SNPs)检测;同时利用实时荧光定量PCR方法对迪庆藏猪不同组织中ADFP基因相对表达量进行检测,并运用SPSS 20.0分析ADFP基因多态性对迪庆藏猪群体不同组织中ADFP基因表达水平的影响。【结果】在迪庆藏猪ADFP基因外显子6上发现3个SNPs,分别为SNP1(C→T)、SNP2(C→T)和SNP3(T→C),其中SNP1和SNP2位点属于低度多态(PIC/He<0.25),SNP3位点属于中度多态(0.25<PIC/He<0.5)。迪庆藏猪不同组织中ADFP基因相对表达量存在显著差异(P<0.05,下同),皮下脂肪中相对表达量最高,其次为肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、腿肌和背肌,心脏中相对表达量最少;另外,ADFP基因SNPs不同基因型迪庆藏猪群体中各组织的相对表达量也存在显著差异,尤其在SNP2位点杂合基因型群体肾脏中相对表达量显著高于纯合基因型群体肾脏中相对表达量,表明ADFP基因SNPs变异对迪庆藏猪组织中ADFP基因表达具有影响。【结论】ADFP基因SNPs变异对迪庆藏猪组织中ADFP基因会产生差异表达,进而影响机体脂肪沉积,ADFP基因可作为迪庆藏猪肌内脂肪沉积的候选基因。

丙酮酸钠对山羊冷冻精子质量的影响

【目的】研究丙酮酸钠对山羊冻精质量的影响。【方法】采用假阴道法采集6只云上黑山羊精液,添加含不同浓度(0、1、5、10、20μmol/L)丙酮酸钠的Optidyl稀释液稀释后进行细管分装。使用SCA全自动精液分析仪测定精子总活力(TM)、直线运动百分率(PM),通过低渗耐受性试验(HOST)检测质膜完整性,用流式细胞仪检测顶体完整性、磷脂酰丝氨酸(PS)分布和活性氧(ROS)等指标。【结果】与0μmol/L丙酮酸钠组相比,1和5μmol/L丙酮酸钠组精子的TM和PM均极显著改善(P<0.01),其他各处理组间无显著差异(P>0.05);1和5μmol/L丙酮酸钠组精子曲线速度和平均路径速度、侧幅摆动、鞭打次数、质膜完整性和顶体完整率、ROS水平均极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05)。流式分析结果表明,冷冻稀释液中丙酮酸钠浓度为1、5和10μmol/L时,正常精子比例显著高于0μmol/L丙酮酸钠组(P<0.05)。【结论】在稀释液中添加丙酮酸钠可有效降低冷冻解冻过程对山羊精子的损伤,冻精运动能力、结构完整性和抗氧化性均显著提升。少量添加丙酮酸钠对精子有改善作用,而过量添加则会出现负面作用。本试验条件下最佳作用浓度为1μmol/L。

肌醇类冰晶抑制剂和海藻糖对山羊精子冷冻保存效果的影响

为进一步降低冷冻解冻过程对山羊精子的理化损伤,本试验系统检验了肌醇类冰晶抑制剂(SIB)和海藻糖对山羊精子的冷冻保护效果。采用假阴道法采集6只云南黑山羊精液,离心洗涤去除精浆后和冷冻稀释液混合,经4℃平衡、液氮气相预冻后直接投入液氮保存。解冻后检测精子活力、顶体、质膜以及低渗耐受性。同时采用透射电镜(TEM)观察冷冻对精子超微结构的影响。结果表明:1,4-环己二醇(1,4-CHD)和海藻糖处理组精子活力(41.35%±8.14%和43.59%±6.23%)、顶体完整性(62.73%±7.62%和64.29%±7.81%)和低渗耐受性(40.29%±7.41%和39.79%±6.58%)均显著高于对照组(35.97%±6.21%、55.46%±8.91%和34.17%±5.68%,P<0.05),且海藻糖可以有效抑制冷冻解冻过程导致的精子凋亡。流式分析结果表明,1,4-CHD不能降低冷冻对山羊精子质膜完整性和磷脂酰丝氨酸(PS)分布的损伤,但是海藻糖可以显著降低冷冻解冻过程中对山羊精子质膜的损伤。电镜结果表明,冷冻对精子质膜和顶体等结构损伤严重,解冻后部分精子质膜发生肿胀、脱落或断裂等现象。而且,顶体外膜存在脱落现象,顶体内容物发生部分甚至完全泄漏。电镜结果进一步证实海藻糖对冷冻精子质膜的保护效果要优于1,4-环己二醇。总之,肌醇类SIB和海藻糖可以降低山羊精子的冷冻损伤,但相对于海藻糖而言,肌醇类SIB并不能降低冷冻对山羊精子质膜的损伤。

乙二醇联合丙二醇用于猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究

本实验以猪GV期卵母细胞为模型,旨在研究乙二醇(EG)联合丙二醇(PROH)作为渗透性冷冻保护剂的冷冻保存方案。将卵母细胞在室温(25℃)和生理温度(39℃)2种冷冻操作条件下,采用2.5%EG+2.5%PROH直接处理10 min(预平衡方式Ⅰ)或分步以3.75%EG+3.75%PROH、7.5%EG+7.5%PROH 2种溶液各处理2.5 min(预平衡方式Ⅱ)进行预平衡,然后Cryotop法玻璃化冷冻保存,解冻后分析其存活、体外成熟及孤雌发育能力。结果表明:在2种温度下,预平衡方式Ⅰ组卵母细胞解冻后2 h的存活率均显著高于预平衡方式Ⅱ组(P<0.05),但存活卵母细胞成熟培养后,在各冷冻组间的存活率无明显差异(P>0.05);冷冻组卵母细胞的核成熟也与新鲜卵母细胞无显著性差异(P>0.05);在相同温度下,预平衡方式Ⅰ组的卵裂率和囊胚发育率均显著高于预平衡方式Ⅱ组(P<0.05);当采用同一预平衡方式时,39℃的冷冻操作条件所获卵裂率和囊胚发育率显著低于25℃(P<0.05);此外,各组间囊胚细胞数均无明显差异(P>0.05)。综上所述,EG联合PROH用于猪GV期卵母细胞的Cryotop法玻璃化冷冻保存时,25℃冷冻操作条件下,采用预平衡方式Ⅰ可获得较高的冷冻存活率及囊胚发育率。

孤雌激活猪囊胚玻璃化冷冻后氧化应激水平研究

本实验以孤雌激活猪扩张囊胚为对象,旨在研究胚胎玻璃化冷冻后的氧化应激水平。选择体外培养至第5天的扩张囊胚采用Cryotop法玻璃化冷冻保存,解冻后恢复培养48 h,分析囊胚扩张率、囊胚细胞数、胞内活性氧(ROS)、超氧化物阴离子(O^(2-))和谷胱甘肽(GSH)的水平及抗氧化酶相关基因(SOD1、SOD2、CAT、GPX4)的mRNA表达量。结果表明:相比于新鲜囊胚,冷冻囊胚在24 h和48 h的囊胚扩张率明显下降(P<0.05),但囊胚细胞数无显著性变化(P>0.05);冷冻囊胚内ROS和O^(2-)水平均显著高于新鲜囊胚(P<0.05),GSH含量显著低于新鲜囊胚(P<0.05);玻璃化冷冻导致囊胚内SOD2 mRNA表达水平升高、CAT和GPX4 mRNA表达水平降低,但不影响SOD1的mRNA表达水平。综上可见,玻璃化冷冻加重孤雌激活猪囊胚的氧化应激水平,表现为ROS和O^(2-)水平升高,GSH含量下降,部分抗氧化酶相关基因mRNA的表达水平异常。

猪孤雌激活4-细胞胚胎玻璃化冷冻保存效果的研究

本实验旨在研究猪孤雌激活4-细胞胚胎的冷冻保存效果。胚胎采用Cryotop法进行玻璃化冷冻保存,解冻后分析其存活率、胞内活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)水平、囊胚发育率及囊胚质量。结果表明:冷冻胚胎体外恢复2 h的存活率与新鲜胚胎无明显差异(100%vs.96.8%,P>0.05),但当其培养时间达到24 h时,存活率显著下降至88.3%(P<0.05)。另外,玻璃化冷冻导致胚胎内ROS水平显著升高(P<0.05),GSH水平显著下降(P<0.05)。与新鲜胚胎相比,冷冻胚胎获得的囊胚发育率明显降低(59.8%vs.26.4%,P<0.05),但囊胚的凋亡细胞率、内细胞团数、滋养层细胞数及总细胞数均无明显差异(P>0.05)。结果显示,玻璃化冷冻猪孤雌激活4-细胞胚胎导致其存活、氧化还原能力和囊胚发育下降,但仍能获得较高质量的囊胚。

化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)和溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica)快速核酸检测方法,本研究根据化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌16S rRNA保守序列设计2对特异性引物及2条TaqMan探针。经对反应体系和反应条件进行优化,建立了化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性结果显示,该方法与金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、肠炎沙门菌和大肠杆菌等22种常见细菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌质粒标准品的最低检出浓度分别为31 copies/μL和65 copies/μL,且变异系数小于3%。对45份临床肺样品的检测结果显示,化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌的阳性率分别为15.5%和24.4%。本研究建立的双重荧光定量PCR方法为牛羊化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌感染的检测提供了敏感、快速的方法。

山羊源无枝菌酸棒状杆菌(Corynebacterium amycolatum)的分离鉴定与耐药性分析

为了对1起羊腹泻病例进行诊断,从腹泻病羊粪便中分离到10株革兰阳性棒状杆菌YN21083~YN210812,对分离株进行形态学和16S rDNA基因鉴定并研究其药物敏感性和耐药基因特征。NCBI数据库BLAST比对鉴定结果显示,10株分离株与无枝菌酸棒状杆菌(Corynebacterium amycolatum)德国分离株FDAARGOS_991的同源性为99.3%~100.0%。16S rDNA基因进化分析显示10株分离株与C.amycolatum参考株形成同一个进化分支,与C.amycolatum参考株之间的同源性为97.2%~100.0%,与C.amycolatum模式菌株ATCC49368之间的同源性为98.3%~99.2%,将10株分离株鉴定为C.amycolatum。药敏试验结果显示,10株分离菌株对青霉素、氨苄西林、阿莫西林克拉维酸、头孢噻吩、头孢呋辛、氟苯尼考、阿米卡星和四环素敏感,对卡那霉素和磺胺甲恶唑耐药。耐药基因PCR检测结果显示,共检测到8种耐药基因aadA1、aadA2、tetA、tetM、qnrS、Sul1、Sul2和Sul3,其检出率分别为30.0%,30.0%,100.0%,60.0%,60.0%,100.0%,10.0%和20.0%。本研究首次报道羊C.amycolatum感染,对羊C.amycolatum感染的预防和控制具有重要指导意义。