大肠癌细胞FoxQ1与EGFR基因表达的相关性

目的探讨大肠癌细胞中FoxQ1与EGFR基因间的相关性,为研究大肠癌中FoxQ1基因在EGFR通路中的作用机制奠定基础。方法应用荧光定量PCR以293-T细胞中FoxQ1及EGFR基因相对表达量为1作为参照,检测大肠癌细胞系DLD1、HT29、LOVO、HCT116中FoxQ1及EGFR基因mRNA相对表达量;荧光定量检测经shRNA-FoxQ1慢病毒干扰后的DLD1细胞(命名为DLD1-shRNAFoxQ1)中EGFR的相对表达量改变;DLD1-shRNA-FoxQ1经EGFR酪氨酸激酶抑制剂Erlotinib HCl和siRNA-EGFR处理后,荧光定量PCR分别检测FoxQ1和EGFR基因mRNA相对表达量。结果(1)FoxQ1在DLD1、HT29、LOVO、HCT116细胞系中的相对表达量分别为83.09、59.58、0.06、0.03,EGFR的相对表达量分别为4.95、3.67、2.08、1.36;(2)经shRNA-FoxQ1干扰的DLD1细胞EGFR表达量随FoxQ1表达量的降低而增高;(3)细胞DLD1-shRNA-FoxQ1、DLD1-shRNA-Control分别经siRNA-EGFR处理抑制EGFR的表达后,FoxQ1表达量随EGFR表达量的降低而增高,经Erlotinib HC1阻断EGFR酪氨酸激酶后,FoxQ1表达量增高。结论大肠癌细胞系中FoxQ1与EGFR基因的表达趋势基本一致;同时两者间可能相互存在负反馈调节机制,从而维持大肠癌细胞中FoxQ1与EGFR高表达的状态。

慢病毒表达载体的构建及沉默FOXQ1基因在大肠癌细胞系DLD-1中的表达

目的:构建FOXQ1基因shRNA慢病毒干扰系统,沉默FOXQ1基因在大肠癌细胞系DLD-1中的表达.方法:根据FOXQ1基因的序列,设计合成3对shRNA干扰序列,退火后连接到载体质粒PLKO.1-puro,将重组质粒转化至STBl3感受态中,涂板培养挑取单菌落,摇菌后小提质粒,选取酶切及测序鉴定正确的重组质粒去内毒素大提,将质粒与辅助包装质粒pRSV-rev、pMDlg-pRRE和pCMV-VSV-G利用磷酸钙法共转染293-T细胞,收集病毒上清,感染目的细胞DLD-1,嘌呤霉素筛选FOXQ1沉默细胞,经荧光定量PCR及Western blot检测干扰效果.结果:酶切及测序结果显示shRNA成功插入载体PLKO.1-puro中,共转染293-T细胞成功获取病毒上清,感染DLD1细胞,经嘌呤霉素筛选出FOXQ1沉默细胞,荧光定量PCR及Western blot鉴定FOXQ1基因表达最高抑制率为90.4%.结论:通过构建FOXQ1基因shRNA慢病毒干扰系统,成功获取FOXQ1基因沉默细胞.为后续FOXQ1基因在肿瘤发生发展的研究奠定实验基础.