应用蛋白芯片检测CIK细胞与其培养上清蛋白谱的改变

目的应用蛋白芯片技术检测不同患者来源的细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK)细胞裂解液和培养上清的蛋白谱改变。方法将3例不同患者来源的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)在体外经细胞因子诱导成CIK细胞,经流式细胞术测定细胞表型后,分别收集培养第20天的CIK细胞和细胞培养上清,应用AAH-BLM-1蛋白芯片分别获得CIK细胞裂解液和细胞培养上清中507个蛋白的改变。结果 CIK细胞在培养第20天,CD3+和CD3+CD56+的T细胞分别为(86.43±10.65)%和(38.58±3.94)%。CIK细胞培养上清液中共有6个蛋白明显升高(Signal≥700,FC≥1.8):MIP-1β(FC=21.28)、GzmA(FC=5.54)、IFN-(FC=2.78)、MCP-1(FC=2.22)、TMPO(FC=2.05)、IL-13(FC=1.81);细胞裂解液共有8个蛋白明显升高(Signal≥700):GzmA(Signal=1 968.77)、ET(Signal=1,398.60)、IL-13(Signal=1 333.47)、TFPI(Signal=959.76)、NRG3(Signal=9 4 4.0 9)、I L-7(Signal=8 6 7.1 2)、MIP-1α(Signal=833.43)、MIP-1β(Signal=704.88)。将上述两组结果对比分析后发现GzmA、IL-13和MIP-1β这3个蛋白在两组中均明显升高。结论 CIK细胞在活化过程中合成并分泌如GzmA、IFN-γ、IL-8和IL-13等多种蛋白产物,这些蛋白产物通过直/间接杀伤肿瘤细胞并促进T细胞增殖活化在抗肿瘤治疗中发挥重要作用。

利用微阵列芯片技术探究基因FOXQ1与大肠癌的关系

目的:应用全基因组表达谱芯片和microR NA芯片检测人结肠癌细胞DLD1在敲低FOXQ1基因前后m RNA和micro RNA的表达改变.方法:抽提两组细胞的RNA,分别与Whole Human Genome Oligo Microarray(4×44 K,Agilent Technologies)全基因组表达谱芯片和mi RCURYTM LNA Array(v.18.0,Agilent Technologies)micro RNA芯片进行杂交,应用genespring、genepix软件对芯片结果进行统计,对全基因组表达谱芯片进行GO、pathway分析,并应用q RT-PCR对部分结果进行验证.应用Microsoft Excel和SPSS17.0软件进行统计学分析.结果:全基因组表达谱的检测结果表明,敲低FOXQ1基因后,在芯片所涵盖的41093个基因中,共有255个基因上调,176个基因下调.q RT-PCR的验证结果与全基因组表达谱芯片的结果基本相符.Micro RNA芯片的检测结果表明,敲低FOXQ1基因后,共有31个micro RNA上调,12个micro RNA下调.结论:本研究了解了FOXQ1基因敲低前后m R N A和m i c r o R N A的表达改变,为后续F O X Q1在结肠癌的发生发展中的作用机制研究提供了重要的线索和实验依据.

应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞

目的探讨应用改良的组织块酶消化法体外培养人大肠癌原代细胞的方法.方法应用结合组织块法和Ⅳ胶原酶消化法的改良的组织块酶消化法体外原代培养人大肠癌细胞,通过对培养条件、促进贴壁、控制污染、细胞纯化等方面的探索得到了大肠癌细胞,并最终用形态学方法(瑞姬氏染色)、和免疫学方法(免疫细胞化学)鉴定所得细胞.结果经改良的组织块酶消化法体外培养的人大肠癌原代细胞,瑞姬氏染色进行细胞形态学鉴定,结果显示胞核呈紫红色,核质比明显增大,符合肿瘤细胞特征;细胞胃肠癌相关糖链抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,C A19-9)进行细胞免疫学鉴定,结果显示胞浆呈棕色,细胞CA19-9阳性.结论改良的组织块酶消化法在培养方法改良、促进贴壁、控制污染和去除杂细胞四方面进行了改进,既可快速获得游离细胞,又充分利用了未彻底消化的组织块.采用该改良的组织块酶消化法原代培养细胞成功率高,所培养的细胞进行初步鉴定证明为大肠癌细胞.

pAcGFP1-N1-FOXQ1真核表达载体的构建及在大肠癌细胞系Colo-320中的表达

目的:构建人FOXQ1(homo sapiens forkhead box Q1)基因真核表达载体pAcGFP1-N1-FOXQ1,并在大肠癌细胞系Colo-320中瞬时表达.方法:利用PCR方法从YR Gene装载了FOXQ1基因全长cDNA序列(NM_033260)的质粒中扩增出FOXQ1的cDNA片段,与真核表达载体pAcGFP1-N1连接,重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定无误后,采用Lipofectamine 2000瞬时转染Colo-320细胞,应用荧光显微镜观察转染效率、Western blot检测FOXQ1蛋白表达水平.结果:成功构建了真核表达载体pAcGFP1-N1-FOXQ1,PCR、双酶切和测序鉴定结果均正确,载体能在Colo-320细胞中正确表达FOXQ1蛋白.结论:成功构建FOXQ1真核表达载体,为进一步开展体内、体外实验,研究FOXQ1基因在肿瘤发生发展中的功能奠定了实验基础.