单基因遗传病分子诊断的新策略和新方法

单基因遗传病具有复杂的表型异质性及遗传异质性,基因突变可涉及点突变、片段缺失/重复、整个基因的缺失/重复、以及动态突变等众多类别。分子诊断技术使得单基因遗传病可在分子水平乃至单个碱基发生变异的情况下做出准确诊断,然而其可靠性问题成为备受瞩目的技术难点。针对不同遗传病使用不同的解决方案,是目前单基因遗传病分子诊断的主流思想。基因诊断相关人员不仅要了解遗传疾病致病基因及其突变特点,还要熟知各种检测技术的特点,合理选择。

云南汉族15个短串联重复序列基因座遗传多态性特征及分析

目的：调查云南地区汉族的D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA 15个短串联重复序列（Short tandem repeat,STR）基因座的遗传多态性。方法：收集云南汉族313名无关个体血样,提取DNA,PCR复合扩增并利用ABI-3130型基因分析仪进行毛细管电泳检测每个样本各基因座的等位基因大小,分别统计每个STR基因座各基因型的频率,并进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。结果：云南汉族这15个STR基因座各基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡（P〉0.05）,杂合度在0.636～0.901,匹配概率在0.034～0.220,单一STR位点的个体识别率在0.780~0.966、非父排除率在0.336～0.797、多态性信息总量在0.555～0.860,联合使用这15个位点所产生的累积个体识别率大于0.999 999 99,累积非父排除率等于0.999 998 408。与中国其他地区汉族群体这15个STR基因座等位基因频率分布相比有较高的相似性,但也有轻微的地区差异。结论：云南汉族的D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA这15个STR基因座具有高度的多态性,与中国其他地区汉族群体有较高的相似性,在法医学中的亲子鉴定和个人识别方面具有较高应用价值。

云南省育龄人群红细胞叶酸水平与出生缺陷的关联研究

目的：通过检测有不良孕产史育龄人群的红细胞叶酸与正常人群红细胞叶酸水平,了解叶酸缺乏和不良孕产史之间的关系。方法：2013年1月-2013年12月收集到云南省第一人民医院遗传诊断中心进行孕前咨询有过不良孕产史育龄人群,检测两组人群与正常人群的叶酸水平,对出生缺陷的相关因素进行统计分析,评估叶酸对于不良妊娠的影响。结果：通过对正常人群组2 639例与不良生育史246例患者的分析,正常人群组与脑部异常儿生育史患者的叶酸水平比较,差异有统计学意义（P〈0.05）,正常人群组与胎儿畸形、自然流产和胎停育、神经管缺陷引产史、唐氏综合征生育史、其他染色体异常生育史组间叶酸水平比较,无统计学差异（P〉0.05）。结论：增补叶酸对预防出生缺陷有一定意义,育龄人群应适时增补叶酸。

云南省育龄人群红细胞叶酸水平参考范围的建立

目的：了解云南省育龄人群红细胞叶酸水平,建立云南地区的红细胞叶酸参考范围。方法：对2013年1、4、7、10月在云南省第一人民医院遗传诊断中心门诊进行孕前咨询的普通育龄人群2 639例分别测定男女性不同年龄阶段红细胞叶酸浓度,建立本地区的红细胞叶酸参考范围,并比较不同性别、不同地区、不同民族之间的差异。结果：云南地区普通育龄人群20~29岁女性红细胞叶酸参考水平为11.31~35.73 ng/ml,20~29岁男性为10.85~33.59 ng/ml,女性叶酸测定数值较男性为高;在云南省各个民族之间叶酸水平差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：建立云南地区红细胞叶酸参考范围为云南地区育龄人群补充叶酸提供了理论依据。

唐氏综合征血清学产前筛查室内质控的目标与方法

血清学产前筛查是通过定量测定孕妇的血清标志物（AFP、F-β—HCG、uE3、Inhibin-A）浓度，综合孕妇的年龄、孕龄、体重等信息，对胎儿患有唐氏综合征（21．三体综合征）、18-三体综合征、开放性神经管缺陷（ONTD）等目标疾病的风险进行筛查评估，从而筛查出需要做介入性产前诊断的高风险妊娠。

云南苯丙酮尿症综合干预技术体系的建立和临床应用

目的：在云南建立一个针对苯丙酮尿症（PKU）的筛查、鉴别诊断、饮食和药物控制及基因诊断、产前诊断的综合干预技术体系。方法：新生儿滤纸片干血斑荧光免疫技术检测血苯丙氨酸（Phe）浓度筛查高苯丙氨酸血症（HPA）患者；采用BH4负荷试验和尿蝶呤谱分析鉴别诊断四氢生物蝶呤缺乏症（BH4D）；通过无苯丙氨酸奶粉、低苯丙氨酸饮食控制诊断的PKU患儿发病，BH4D患儿补充BH4等药物预防患儿致愚。采用PAH基因13个外显子测序和PAH—STR连锁技术，完成基因诊断和产前诊断，预防患儿出生。结果：①2006年1月-2013年9月筛查了254218例新生儿，确诊了16例经典型PKU，4例中度PKU，9例轻度HPA，1例BH4D。云南新生儿中PKU的发生率为1／11555（22／254218）。②对18例经典型和中度PKU患儿使用无苯丙氨酸奶粉和饮食控制，并监测血Phe浓度均在正常范围内，婴幼儿智力发育正常。筛查出的2例中度PKU患儿家属拒绝治疗。③通过对云南20例经典型PKU患者PAH基因测序发现云南地区最常见的异常为11243R（30．0％），其次为Y356X（10．0％）。R111X（7．5％），IvS4＋2T〉A（7．5％），V399V（7．5％），主要涉及第7、11、3外显子和第4内含子。④完成3例胎儿PKU产前诊断，2例胎儿检出仅为基因突变携带者，分娩后随访正常；另1例胎儿仅能证明至少为突变携带，但因未检出先证者另外1个突变，加之连锁分析多态性不足，不能得出准确诊断结论，后孕妇遗传咨询后选择终止妊娠。结论：新生儿足跟血筛查PKU患儿，通过鉴别诊断确诊后，进行药物和饮食干预，同时采用PAH基因测序和PAH—STR技术，完成基因诊断和产前诊断，在产前预防患儿出生，形成一个相互支持的立体干预体系，可有效提高PKU预防和干预效率。

154例脊肌萎缩症疑诊患者的基因诊断及其临床价值

目的对疑诊为脊肌萎缩症（SMA）患者的运动神经元存活基因SMNl进行缺失分析，探讨基因诊断对SMA的临床应用价值。方法采用PCR和限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）技术，对2007年1月至2014年12月于云南省第一人民医院遗传诊断中心和昆明医科大学第四附属医院神经内科就诊的154例SMA疑诊患者和20名健康体检者进行SMN1基因外显子7和外显子8缺失检测，统计上述基因的缺失频率，采用SPSS13．0软件对各缺失类型在不同SMA型别间的差异进行显著性检验。结果154例疑诊患者中，101例检出SMN1基因外显子7纯合缺失，基因诊断率为65．6％（101／154）。101例SMNl基因纯合缺失病例中，外显子7和8均纯合缺失为98例，占97．0％（98／101）；3例仅外显子7纯合缺失，占3．0％（3／101）；未见外显子8的单独缺失。基因诊断阴性患者经过临床随访，其中4例可维持SMA的诊断，105例SMA确诊患者中I型68例，Ⅱ型27例，Ⅲ型10例，分别占64．8％（68／105）、25．7％（27／105）和9．5％（10／105），未发现Ⅳ型SMA。20名健康体检者未检出SMN1基因外显子7和8缺失。结论PCR—RFLP技术对于诊断SMA患者具有无创性、简单、灵敏度和特异性较高的特点，可作为疑诊SMA患者的首选诊断和排除诊断方法；强化SMA临床诊断标准并对基因诊断阴性的疑诊患者进行重新评估，将有助于提高临床诊断的准确率和检出率。

多重连接依赖探针扩增技术在假肥大型肌营养不良症基因诊断中的应用

杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）为儿童期最常见的重症肌营养不良疾病，多于5岁前发病，大多数患有DMD的男童12岁后基本丧失行走能力，少数存活至25岁。贝氏肌营养不良（Becker muscular dystrophy，BMD）临床症状轻于DMD，多于16岁后丧失独立行走能力。DMD和BMD都是由定位于Xp21．2的肌营养不良蛋白（dystrophin）基因突变引起的X连锁隐性遗传疾病。目前此病尚无有效的治疗方法，故确诊先证者、检出携带者并实施有效的产前诊断，杜绝患儿出生是干预出生缺陷的关键手段。

脊肌萎缩症的基因诊断和产前诊断研究进展

脊肌萎缩症（Spinal muscular atrophy,SMA）是一类由脊髓前角α运动细胞退行性变而引起的进行性、对称性肢体近端肌无力和萎缩的常染色体隐性遗传病,在欧洲发病率较高,为1/6 000～1/10 000〔1〕,居致死性常染色体隐性遗传病第二位,仅次于囊性纤维化,人群中携带者频率为1/40～1/60〔2〕。

脊肌萎缩症的基因诊断和产前诊断

目的:建立有效快速的脊肌萎缩症(SMA)的基因诊断和有脊肌萎缩症患儿生育史孕妇的产前诊断方法。方法:应用聚合酶链式反应和限制性片段多态性(PCR-RFLP)检测方法对87例疑似患儿SMN基因第7、8外显子进行缺失分析;通过PCR-RFLP和JK53CA1/2、D5S637和CATT1三个STR位点连锁分析技术对5例有脊肌萎缩症患儿生育史的孕妇进行产前诊断。结果:在87例疑似患儿中发现有30例患儿SMN基因第7、8外显子缺失,2例SMN基因第7外显子缺失,而在5例有SMA生育史孕妇产前诊断胎儿为SMA患者风险低,建议正常分娩。结论:PCR-酶切分析方法和STR连锁分析方法准确、简便,可作为脊肌萎缩症的基因诊断和产前基因诊断的方法。

FISH技术快速诊断胎儿染色体数目异常

目的:使用荧光原位杂交(FISH)技术对胎儿染色体数目异常进行快速检测并评估其临床应用价值。方法:使用第13、18、21、X和Y5条染色体特异性的FISH探针对245例孕妇采用未经培养的新鲜羊水进行产前诊断,并与同时进行的羊水染色体检查结果进行对照。另外,选取36例染色体分析结果异常的存档标本(包括20例羊水标本和16例外周血/脐带血标本)对该检测技术进行验证。结果:使用FISH方法成功诊断唐氏综合征9例,18-三体综合征2例,性染色体数目异常3例,和同时进行的常规羊水染色体检查结果一致。但有4例经羊水染色体检出的染色体数目和结构异常,FISH因固有技术限制无法检出。在验证实验中,36例存档标本,全部染色体数目异常均能成功检出,成功率100%。结论:荧光原位杂交(FISH)技术检测第13、18、21、X和Y数目异常是准确快捷的产前诊断方法,值得推广应用。

地中海贫血基因检测方法的研究进展

地中海贫血（简称地贫）在东南亚、地中海等地区高发[1]，也是目前世界上发病率最高的遗传性溶血性贫血，是血红蛋白病中危害最严重的一种[2]。其中以α-地贫，β-地贫最为常见，在我国地贫高发于长江以南广西、广东、海南、云南、贵州、四川等地区，其中仪一地贫基因携带者检出率为2％-18％，β-地贫为1％-7％[3-6]。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者基因突变32例分析

目的探讨采用突变特异性扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)技术检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)缺乏症患者基因突变的可行性。方法采用突变特异性扩增系统技术对2007至2010年3月在本院遗传诊断中心门诊就诊的云南省本地人群中,既往有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症生育史,或孕前筛查、新生儿筛查发现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症高风险胎儿,共计32例(男性为15例,女性为17例)进行葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者三种常见基因突变检测(本研究遵循的程序符合本院人体试验委员会制定的伦理学标准,征得受试者本人或其监护人的知情同意)。结果 32例确诊为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症高风险患者中,23例检出三种常见基因突变,其中1388(G→A)突变为12例,1376(G→T)突变为9例,95(A→G)突变为2例,这三种突变占本组患者的71.9%(23/32)。结论突变特异性扩增系统技术可作为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者常规基因诊断和产前诊断方法。突变特异性扩增系统技术对胎儿,既可检出男性患者,又可检出女性杂合子,但对少数患者仍需采用其他技术检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症患者基因突变。

成骨发育不全研究进展

成骨发育不全（Osteogenesis Imperfecta,OI）是一种少见的先天性骨骼发育障碍性疾病,由于患者易骨折,因此又称脆骨病。加之伴有蓝巩膜和耳聋等临床症状,又称脆骨-蓝巩膜-耳聋综合征。它是一种全身结缔组织疾病,以骨脆性增加及胶原代谢紊乱为特征。