用于生物人工肝的大量猪肝细胞低温冻存技术

目的比较大量猪肝细胞程序冻存与常规冻存的效果。方法采用二步法胶原酶经肝静脉逆行灌注的方法分离猪肝细胞,分离的肝细胞根据冻存方法与冻存袋的不同分5组:a组,50 mL冻存袋,程序冻存;b组,100 mL冻存袋,程序冻存;c组,50 mL冻存袋,常规冻存;d组,100 mL冻存袋,常规冻存;e组,新鲜分离的肝细胞。各冻存组解冻后,比较各组的肝细胞活性、贴壁率、LDH漏出量及白蛋白合成能力。结果新鲜分离的肝细胞产量为(1.8±0.4)1010/肝,活性高达(90.5±1.7)%,培养后贴壁率为(70.5±8.5)%。采用程序冻存的a、b组在肝细胞活性、贴壁率、LDH漏出量及白蛋白合成能力方面明显优于常规冻存的c、d组(P<0.05),但与e组新鲜分离的肝细胞相比,其解冻后肝细胞的活性、贴壁率及蛋白合成能力均降低(P<0.05),LDH漏出量增加(P<0.05)。相同冻存方法条件下,50 mL袋装与100 mL袋装冻存效果差异无统计学意义(P>0.05)。结论采用袋装程序冻存法大量冻存猪肝细胞可满足生物人工肝对肝细胞活性及数量的要求。

成人脂肪肝整肝肝细胞分离及大量冻存的实验研究

目的建立成人脂肪肝整肝肝细胞的分离以及人肝细胞大量冻存技术,为生物人工肝提供稳定的人肝细胞来源。方法采用胶原酶经肝静脉逆行灌注的方法分离成人重度脂肪肝的整肝肝细胞,并比较常规冻存和程序冻存后肝细胞在细胞活性、贴壁率、LDH漏出量及白蛋白合成能力的差异。结果采用添加N-乙酰半胱氨酸(NAC)的胶原酶灌注液分离肝细胞的产量为(7.4±0.5)×10~6 cells/g肝组织,活性为(81.4±3.4)%,而未添加NAC组的肝细胞产量为(5.6±0.8)×10~6 cells/g肝组织和活性为(67.3±5.0)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。分离的人肝细胞采用程序冻存后在细胞活性、贴壁率及白蛋白合成能力方面均相应高于常规冻存组(P<0.05),LDH漏出量低于常规冻存组(P<0.05)。结论应用添加NAC的胶原酶灌注液经肝静脉逆行灌注可提高脂肪肝整肝肝细胞分离的活性及产量,采用程序冻存的方法可以提高冻存人肝细胞的活性,满足生物人工肝对肝细胞的需要。