生物素及膜偶联间歇透析发酵对黄色短杆菌生产L-亮氨酸的影响

生物素作为微生物的生长因子,对生长速率、细胞膜通透性、代谢产物的生成等方面具有重要作用。为提高黄色短杆菌产L-亮氨酸产量,降低副产物生成,在30 L发酵罐水平研究了在培养基中添加20、50、80、120μg/L四种不同质量浓度生物素,对黄色短杆菌产L-亮氨酸的影响。结果表明:培养基中添加50μg/L生物素,黄色短杆菌发酵44 h,L-亮氨酸的产量最高,达到60 g/L,糖酸转化率为22%,副产物L-丙氨酸的质量浓度为8 g/L。在最适生物素浓度下,发酵36 h后,采用膜偶联间歇透析发酵工艺,发酵周期延长至56 h,L-亮氨酸的糖酸转化率为25%,较普通发酵工艺约提高13. 6%,副产物L-丙氨酸的浓度降低约71. 3%,L-亮氨酸的总产量提高了16. 7%。研究结果对提高糖利用率、降低副产物、提高生产效率等方面具有重要意义。

CRISPRi干扰中心代谢基因转录对苏氨酸合成的影响

苏氨酸是重要的饲料氨基酸,需求量持续增加,提高苏氨酸发酵产率和糖酸转化率,降低生产成本已成为一个重要课题。该实验以苏氨酸工程菌Escherichia coli THRD为出发菌,利用CRISPRi(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference)技术研究中心代谢9个基因转录水平的改变对苏氨酸合成的影响。发酵结果显示,干扰zwf、pfk A和glt A基因的转录水平提高了苏氨酸的合成效率,对应菌株苏氨酸产量分别为60. 3、64. 6和65. 8 g/L,与出发菌(50. 9 g/L)相比,分别提高了18. 5%、26. 9%和29. 3%。糖酸转化率分别为40%、38%和39%,与出发菌(34%)相比,分别提高了17. 7%、11. 8%和14. 7%。结果表明,通过CRISPRi干扰中心代谢基因的转录水平,可以调节合成代谢网络,使更多碳源流向苏氨酸,提高苏氨酸的合成效率。同时,该研究也为其他生物制品工程菌的构建提供了参考。

L-2-氨基丁酸大肠杆菌生产菌株的构建

L-2-氨基丁酸作为新型药物的关键手性前体,在化工和制药行业应用广泛。该文以1株生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli) THRD为出发菌株,逐步延伸代谢途径,构建了L-2-氨基丁酸高产菌株。首先,分别把苏氨酸脱水酶编码基因ilv A2和ilv A4在THRD中过表达,菌株THRD/p Trc99a-ilv A2在5 L发酵罐中分批补料发酵,2-酮基丁酸积累量达到18 g/L。然后,分别与ilv A2串联表达酪氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶编码基因tyr B、gdh和bcdBS,将L-2-酮基丁酸转化为L-2-氨基丁酸,菌株THRD/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量达到19 g/L。最后,研究了阻断L-苏氨酸输出途径对发酵的影响,菌株THRDΔrht C/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量提升至22 g/L。因此,通过代谢途径延伸可以有效地将L-苏氨酸生产菌株转变为L-2-氨基丁酸生产菌株。该研究为L-2-氨基丁酸高产菌株的构建奠定了基础,且对其他延伸代谢途径获得新产品的代谢工程研究提供了参考。

谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1/ssDNA基因组编辑系统优化

谷氨酸棒状杆菌作为重要的微生物细胞工厂,基因组修饰已经成为调节目标代谢物的首要途径。为了提高基因定点突变的编辑效率,建立了高效省时的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因组编辑系统。利用卡那霉素抗性作为筛选标记,构建了1株严谨的单链模式菌M-1,用于验证与统计编辑效率。首先,采用强启动子Ptuf,优化了切割效率;其次,利用重组酶RecT和合理长度与添加量的ssDNA,优化了重组效率。实验结果显示:在启动子Ptuf和RecT的双重作用下,采用滞后链(70bp、12.5μg)优化组合方式,使基因编辑效率提升至(80±5.7)%。由RecT介导的CRISPR-Cpf1/ssDNA基因组编辑系统可在很大程度上加快谷氨酸棒状杆菌代谢工程改造。