基于Solexa高通量测序的黄曲条跳甲转录组学研究

黄曲条跳甲Phyllotretastriolata(Fabricius)是十字花科蔬菜的重要害虫。为深入了解其遗传信息,本研究应用新一代高通量测序技术Illumina'sSolexa平台对黄曲条跳甲成虫的转录组进行测序,并结合SOAPdenovo拼接聚类等分析软件,获取大量的EST和挖掘功能基因。本文最终获得了4924条序列重叠群(contig),其中包含2209种与黑腹果蝇Drosophilamelanogaster蛋白基因具直系同源的独立基因(unigene)和610种黄曲条跳甲物种特有的unigene。结合GeneOntology(GO)数据库进行分析,发现大部分的unigene具结合能力(bindingcapability)和催化活性(catalyticactivity);上百种unigene可聚类于生物学过程分类中的配子发生、生殖腺发育和交配行为等重要功能。另外,结合KEGGPathway数据库分析发现,共有363种unigene参与或涉及了40种代谢路径,其中生物钟调控路径和植物次生代谢物路径等相关基因的发现,有助于深入研究黄曲条跳甲行为发生的内在机理。Solexa高通量测序技术作为昆虫功能基因组研究的重要手段,为发掘黄曲条跳甲功能基因发挥了重要作用,也为在分子水平上研发黄曲条跳甲的防治新策略提供了更翔实的基因信息。

分子标记技术在昆虫入侵研究中的应用

遗传变异与种群持续性及其进化潜力密切相关,而生物入侵导致种群遗传变异或遗传多样性的改变为研究自然界中各种生态和进化问题提供了理想模式。分子标记技术是调查种群遗传变异的重要工具,揭示了入侵种的入侵过程和结果,并预测未来的发生情况。本综述归纳了分子标记技术在昆虫入侵机制研究中的应用,以典型的研究个案为例,分别综述了分子标记技术在隐蔽入侵的监测应用,分子标记技术在重构入侵历史研究中的推算方式,分子标记技术在探索种群遗传变异与成功入侵机制方面取得的重要进展,并进一步介绍了高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)分析在昆虫入侵研究中的应用前景。

生物信息学在计算机辅助农药分子设计中的应用

随着生命科学、数学、物理学和计算机科学的相互交叉,生物信息学越来越显示出其重要性,尤其是在新药的研究和开发中。综述了生物信息学在药物靶点识别和药物分子设计中的应用,并探讨了生物信息学在农药分子设计中的重要作用。生物信息学的应用无疑将进一步推动农药的开发进程。

黄曲条跳甲E型前列腺素受体cDNA的鉴定及表达谱研究

前列腺素(Prostaglandin,PG)的受体(E-Prostaglandin Receptors,EP)与细胞信号传导密切相关,对于昆虫免疫、生殖等具有重要意义。为促进重要蔬菜害虫黄曲条跳甲前列腺素受体的功能研究,结合转录组测序和荧光定量PCR等方法,分析了黄曲条跳甲PGE2受体EP(PsEP)的cDNA序列及基因表达情况。结果表明,PsEP的cDNA的开放阅读框为1 323 bp,编码323个氨基酸,含有典型的G-蛋白耦联受体家族1结构域,但其亚型分类还有待进一步验证。PsEP分子在成虫的多种组织器官中都有表达,但生殖系统和中肠相对较高。此外,雌雄之间对比发现,雄虫PsEP表达量均比雌虫对应组织器官的表达量要高。

基于转录组数据高通量发掘扶桑绵粉蚧微卫星引物

【目的】扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley是我国重要的检疫性害虫。简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)研究在遗传图谱和物理图谱的构建、分子标记辅助育种、品种鉴定、基因定位、遗传多样性、动植物分类和进化等方面具有重要意义。筛选的SSR引物将为扶桑绵粉蚧遗传多样性分析、进化分析及入侵生物学等奠定基础。【方法】利用高通量搜索的方法对扶桑绵粉蚧转录组中28 120条unigenes的数据进行搜索。【结果】共找到1 781个SSR位点。扶桑绵粉蚧转录组中SSRs的主要重复类型是单核苷酸重复,占SSR总数的89.44%;其次是三核苷酸重复,占SSR总数的7.52%。单核苷酸重复里主要是A/T基序,占了总量的87.42%。基于筛选的SSRs,运用Primer 3软件进行引物的批量设计,共有481个unigenes成功设计引物,共设计出1 228对引物。【结论】研究表明利用扶桑绵粉蚧转录组数据开发SSR标记是可行的,本研究开发的引物将为扶桑绵粉蚧遗传多样性分析、进化分析及入侵生物学等奠定基础。

应用微卫星标记分析不同桔小实蝇种群的遗传多样性

为探究不同桔小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）地理种群的遗传变异、入侵来源和扩散情况,利用13对引物对中国南方10省区、泰国、夏威夷、菲律宾和老挝的30个桔小实蝇种群共180个个体的遗传多样性水平进行了研究。Popgene32和NTSYS-pc2.10e软件分析结果表明：30个不同桔小实蝇种群的遗传相似度在0.3599~0.9153范围内。种群的Nei氏基因多样性指数平均为0.6464±0.1026,Shannon信息指数I平均为1.2845±0.2632,提示桔小实蝇种群具有较丰富的遗传多样性。UPGMA聚类分析显示,福建地区和海南地区分别独立一支,广东地区和台湾地区种群聚成一支,而广西、泰国、湖南、云南、老挝、四川、重庆和贵州地区聚为一大支系。据此提出泰国种群和老挝种群是最早入侵我国的种群,云南地区是最早的入侵地,广西地区可能为又一较早入侵地。

扶桑绵粉蚧组织蛋白酶B基因的克隆、原核表达和不同发育阶段表达分析

昆虫组织蛋白酶B在昆虫代谢过程中发挥重要作用。本研究利用RACE技术克隆了扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley组织蛋白酶B基因的开放阅读框(ORF)序列,命名为PsCb(GenBank登录号:JQ727999)。生物信息学分析表明,该基因的开放阅读框包含927bp的片段,编码308个氨基酸。多序列比对表明,该基因编码的蛋白在N端变异较大,在C端保守性高。组织蛋白酶B基因的系统进化树结果表明扶桑绵粉蚧组织蛋白酶独自成为一支。原核表达电泳检测到一条大约35kDa的目的条带,与预测的蛋白分子量相符。组织蛋白酶B基因在扶桑绵粉蚧各个虫态均有表达,卵期表达量相对较低,2龄若虫期达到最高峰,然后下降。本研究为进一步研究该基因的功能并开发出组织蛋白酶抑制剂,从而研制出扶桑绵粉蚧杀卵剂和胚胎发育抑制剂等提供理论依据。

扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆及不同发育阶段的表达分析

【目的】扶桑绵粉蚧是我国重要的入侵生物,其繁殖能力强,能危害棉花、扶桑、向日葵、南瓜、番茄等多种我国重要的经济作物。克隆扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)基因,可为揭示扶桑绵粉蚧GSTs的生理功能提供参考。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶基因全长,并采用生物信息学方法分析其结构特征,用实时荧光定量PCR的方法研究其各个虫态的表达谱。【结果】克隆了扶桑绵粉蚧谷胱甘肽S-转移酶基因全长序列,该基因的开放阅读框包含651bp的片段,编码217个氨基酸。DNA编码区由4个内含子和5个外显子组成,内含子的长度分别为90,123,67和70bp;分隔的5个外显子的长度分别为18,50,96,80和500bp。功能域分析结果显示,该蛋白在N末端和C末端均有GST的类似结构位点。多序列比对及系统进化树构建结果表明,该蛋白属Zeta家族GSTs,将其命名为PsGSTzl。PsGSTzl mRNA在扶桑绵粉蚧的不同虫态中都有表达,在1龄幼虫中的表达量最高。【结论】成功克隆的PsGSTzl基因在不同虫态中差异表达,为进一步揭示该基因在虫体的代谢作用奠定了基础。

黄曲条跳甲谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)基因序列特征及表达分析

氯离子通道与农业害虫的抗药性发生有密切关联。本研究结合转录组测序及荧光定量PCR技术,鉴定和分析黄曲条跳甲Phyllotreta striolata(Fabricius)谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)的基因序列特征、功能及基因表达谱。结果表明:本研究所获得的GluCl cDNA序列长度为1430bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)长为1344bp,编码447个氨基酸残基。其推测蛋白分子主要含神经递质分子胞外结合域和胞内跨膜域两大功能域,其亲水的胞外结合域又含有2个由半胱氨酸二硫键形成的氨基酸残基桥环,表现出GluClα亚基的典型特征。cDNA序列的系统发育分析表明,该GluCl与其他昆虫的GluClα高度同源,而在脊椎动物中则与γ-GABA或甘氨酸配体门控氯离子通道同源。荧光定量PCR分析表明,该GluCl基因在黄曲条跳甲雌雄成虫的不同部位中都有表达,但是在头部的表达量非常高,如雄虫头部的表达量是其精巢的65.7倍、是其中肠的227.5倍,揭示GluCl基因在中枢神经组织中具有重要作用。本研究为进一步研究GluCl介导的黄曲条跳甲抗药性的发生及其分子机理奠定了基础。

扶桑绵粉蚧环指蛋白基因的克隆及其序列特征与表达谱分析

【目的】克隆我国重要入侵生物扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)环指蛋白基因(PsRing3)序列,分析其序列特征与表达谱,为进一步揭示扶桑绵粉蚧环指蛋白基因的生理功能提供参考。【方法】用RACE方法克隆扶桑绵粉蚧环指蛋白基因,用生物信息学方法对其编码蛋白进行结构和系统进化分析,用实时荧光PCR方法研究其在各个虫态(卵期及1龄、2龄、3龄若虫和成熟雌虫)中的表达差异。【结果】克隆的扶桑绵粉蚧环指蛋白基因的开放阅读框包含678bp的片段,编码225个氨基酸。多序列比对表明该蛋白非常保守。系统进化树分析表明,扶桑绵粉蚧与半翅目的豆无网长管蚜(Acyrthosiphon pisum)聚为一支,然后与人体虱(Pediculus humanus corporis)相聚。环指蛋白基因在扶桑绵粉蚧各个虫态均有表达,但以卵期最高,1龄、2龄若虫和成熟雌虫表达量相当。【结论】成功克隆了扶桑绵粉蚧环指蛋白基因,其在不同虫态中的差异表达为进一步揭示该基因在虫体中的生理功能奠定了基础。

桔小实蝇14-3-3基因的克隆和表达谱分析

【目的】克隆桔小实蝇14-3-3蛋白的基因(Bactrocera dorsalis14-3-3,Bdor14-3-3),研究Bdor14-3-3mRNA在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其是否参与了桔小实蝇的发育过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆Bdor14-3-3;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法,研究Bdor14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了Bdor14-3-3基因,其编码区长度为747 bp,编码248个氨基酸残基。氨基酸序列一致性分析表明,在昆虫纲中,桔小实蝇与刺舌蝇14-3-3蛋白的序列一致性最高,为98.8%,与豌豆蚜的序列一致性最低,为85.4%。实时荧光定量PCR分析表明,Bdor14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织和发育时期都有表达;在雌虫头(去除触角)和翅中的相对表达量均较高,分别是触角的1.39和1.44倍;在雄虫胸和后足中的相对表达量均较高,分别是前足的1.28和1.23倍。在蛹的早期发育过程中Bdor14-3-3 mRNA表达量逐渐升高,到7 d蛹期相对表达量达到最高峰,是10 d蛹的4.91倍。【结论】克隆获得了Bdor14-3-3基因,其表达的14-3-3蛋白可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其在蛹的发育过程中Bdor14-3-3可能发挥着重要作用。

扶桑绵粉蚧钙调蛋白基因的原核表达与表达谱分析

【目的】探究我国重要入侵生物扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)钙调蛋白基因(PsCam)在各虫态中的表达差异及PsCam蛋白在体外的异源表达,为进一步揭示PsCam的生理功能提供参考。【方法】克隆PsCam基因的ORF,推导其编码的氨基酸序列,采用生物信息学方法,分析扶桑绵粉蚧钙调蛋白的结构。构建PsCam原核表达载体,将其转化到大肠杆菌中进行诱导表达,并对产物进行纯化。采用实时荧光PCR方法,分析该基因在扶桑绵粉蚧各个虫态中的相对表达量。【结果】扶桑绵粉蚧钙调蛋白基因的氨基酸序列分析结果显示,该蛋白没有信号肽,具有2个EF-hand钙结合结构域,有13个Ca2+结合位点。成功构建了原核表达载体pET28a-PsCam,经诱导表达后获得了重组的Cam蛋白,目的蛋白的分子质量约为17ku。PsCam mRNA在不同虫态的扶桑绵粉蚧中都有表达,在成熟雌虫中的表达量最低,在1龄幼虫中的表达量最高,是成熟雌虫的7.1倍。【结论】在原核表达系统中诱导表达了重组PsCam蛋白;PsCam基因在扶桑绵粉蚧不同虫态中差异表达。

黄曲条跳甲JH诱导蛋白基因的克隆与表达分析

【目的】克隆黄曲条跳甲保幼激素诱导蛋白(Juvenile hormone-inducible protein,Ps-jhip-1)基因,并分析其表达特征。【方法】克隆黄曲条跳甲Ps-jhip-1基因,对其进行系统发育分析,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。利用荧光定量PCR方法分析Ps-jhip-1基因在黄曲条跳甲不同组织器官及1个生物钟周期内表达量的变化趋势。【结果】成功克隆了Ps-jhip-1全长cDNA,其长度为1 252bp,开放阅读框为1 230bp,编码409个氨基酸。Ps-jhip-1基因编码蛋白具有典型的类蛋白激酶C超家族的蛋白功能域,不具备保幼激素膜受体分子的特征。系统发育分析结果表明,Ps-jhip-1与同为鞘翅目昆虫赤拟谷盗的8种JH诱导蛋白基因聚为一支。荧光定量PCR结果表明,Ps-jhip-1基因mRNA在黄曲条跳甲雌雄成虫的多种组织器官中都有表达,其中在触角和头部的表达量相对较高,而在中足和后足的表达量相对较低,约为触角表达量的6%;Ps-jhip-1基因mRNA表达水平在1个生物钟周期内存在4个下调表达时段,但并未表现出明显的节律性特征。【结论】成功克隆了黄曲条跳甲Ps-jhip-1基因,并分析了其在不同组织及1个生物钟周期内表达量的变化。

黄曲条跳甲双孔道钾离子通道基因序列特征及不同组织的表达量分析

昆虫细胞膜钾离子通道与多种生命活动密切相关。结合转录组测序及荧光定量PCR技术,鉴定和分析黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata(Fabricius))钾离子通道基因的序列特征及不同组织器官的mRNA表达谱。结果表明:所获得的钾离子通道蛋白基因(twk)cDNA的开放阅读框为1 137 bp,共编码378个氨基酸残基。蛋白结构分析表明:其含有4个钾离子通道蛋白的跨膜区(M1～M4)和2个孔道结构域(1P～2P),分别位于M1与M2、M3与M4之间,即双孔道钾离子通道。序列保守性分析表明:1P的核心序列为甘氨酸-酪氨酸-甘氨酸(GYG)模体,2P的核心序列为甘氨酸-亮氨酸-甘氨酸(GLG)模体。荧光定量PCR分析表明,twk在黄曲条跳甲雌雄成虫的不同部位中都有表达,但是在精巢或卵巢、中肠和头部的表达量相对较高;雌、雄成虫各组织器官之间的相对表达量没有显著差异。

RNA干扰在植物寄生线虫上的运用

综述RNA干扰作为一种有效的研究植物寄生线虫功能基因组的反向遗传学技术及其相关特征,以为通过植物介导的RNA干涉成功运用于研究及植物抗线虫育种提供新策略。

黄曲条跳甲RCN基因的克隆与表达

【目的】克隆黄曲条跳甲钙离子结合蛋白(reticulocalbin,RCN),并分析其序列特征和表达谱。【方法】结合转录组测序及荧光定量PCR技术,鉴定和分析黄曲条跳甲钙离子结合蛋白基因的序列特征、功能及表达谱。【结果】获得的黄曲条跳甲RCN基因的cDNA序列全长为1 197bp,开放阅读框为984bp,共编码327个氨基酸残基。其蛋白分子含有5个亮氨酸拉链结构域(EF-hand),与钙离子结合的模体可能为DX(N/D)X(D/N)XXXXXXE。cDNA序列的系统发育分析表明,黄曲条跳甲的RCN与赤拟谷盗的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,RCN在黄曲条跳甲雌雄成虫的不同部位都有表达,具有一定的广谱性,其中在头部和中肠的表达量相对较高;触角中雌虫的相对表达量是雄虫的1.9倍,而在生殖系统中,雄虫的相对表达量是雌虫的2.1倍。【结论】成功鉴定了黄曲条跳甲的一种钙离子结合蛋白基因,初步分析了该基因与钙离子结合的模体序列及在虫体不同部位转录水平的表达情况。

黄曲条跳甲钾离子通道基因实时荧光定量PCR质粒标准品的构建

构建黄曲条跳甲钾离子通道基因(twk)荧光实时定量PCR标准品。利用twk基因为目的基因设计引物,通过PCR、电泳、胶回收,然后与pMD18-T Vector连接并转化到感受态大肠杆菌中;氨苄青霉素筛选出白色菌落,进行菌落PCR及测序鉴定其特异性,根据OD值确定浓度,制备梯度浓度参考标准品,制作标准曲线。成功构建了twk基因实时荧光定量PCR质粒标准品,为黄曲条跳甲体内twk的精确定量,以及其他靶标基因表达的定量分析提供了重要参考。

两个扶桑绵粉蚧细胞色素P450基因的克隆与分析

为了深入研究入侵生物扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)对农药等外源物的作用机制,采用RACE的方法克隆了2个扶桑绵粉蚧细胞色素P450基因的开放阅读框序列.其中一个基因的开放阅读框包含1 536 bp的片段,编码512个氨基酸,其相对分子质量为59 843.5,理论等电点为8.79,推测属于稳定存在的蛋白,且没有跨膜区域;其具有WXXXR(WKNLR)、EXXR(ETLR)序列及FXXGXXXCXG/A(FGEGPRICIG)血红色素结合位点等细胞色素P450特有的氨基酸序列,其中ETLR属于CYP6家族所特有,且其blast比对均与昆虫体内CYP6A家族的相似性较高,将其命名为PsCYP6a1.另一个基因的开放阅读框包含1 575 bp的片段,编码525个氨基酸,相对分子质量为61 246.62,理论等电点为8.87,推测属于稳定存在的蛋白,且没有跨膜区域;与前者相似,也包含了相应的细胞色素P450基因的保守位点,将其命名为PsCYP6a2.2个扶桑绵粉蚧细胞色素P450基因的核苷酸序列的相似性为55.56%,氨基酸序列的相似性为39.41%,相似的残基占了44.12%.