乙型病毒性肝炎相关人体基因研究的策略

乙型肝炎病毒感染人体后,发病率和感染结局存在着种群、地域和个体的差异,其中环境因素、病毒本身的毒力并不能完全阐释其机制,宿主遗传因素可能发挥了重要作用。近年来,随着人类基因组计划的完成,我们应该更加重视遗传因素在乙型肝炎发生、发展和致病作用中的研究。考虑到感染的发生、临床表现、临床结局多样性,以及疾病、宿主基因、环境因素三者间关系的复杂性,可能涉及到多基因相互作用,遗传异质性等特征开展乙型病毒性肝炎相关宿主基因研究需要基因组学、生物信息学、分子遗传学等技术和方法,本文讨论了筛选基因的候选基因策略和基因组宽幅扫查策略的特点,目的基因的遗传学分析方法等问题。

抗肿瘤细胞多药抗性基因MDR1和MRP1双靶位自剪切核酶的合成及其在体外活性研究

多药耐药基因MDR1和 (或 )MRP1过度表达是引起肿瘤细胞对化疗药物产生多重耐药性的重要原因 .在以往研究抗MDR1基因的核酶 (196MDR1 Rz)的基础上 ,合成了针对MRP1基因 2 10和 730编码子的核酶 (2 10MRP1 Rz ,730MRP1 Rz) ,同时利用RNA二级结构分析程序mfold 3 0设计合成了一种双靶位自剪切核酶体系 (Coat) .将 196MDR1 Rz和 2 10MRP1 Rz基因同时载入到该体系中 ,建立了抗MDR1 MRP1双靶位核酶 .在无细胞体系中对上述核酶进行的生物活性实验表明 ,2 10MRP1 Rz与 730MRP1 Rz相比能够更有效地切割底物 ;载入Coat的抗MDR1和MRP1核酶均能得以有效释放 ,同时切割各自的靶RNA序列 ,切割效率与单靶位核酶一致 ;

肝纤维化和肝硬变基因治疗的研究现状

肝硬变是慢性肝病晚期的组织学改变,表现为肝实质细胞广泛破坏和再生,纤维结缔组织大量增生造成肝小叶和血管结构的无序化,结果常引起肝功能失代偿、食管静脉曲张、腹水和肝癌等致死性并发症,长期以来,对肝纤维化和肝硬变缺乏有效的治疗方法。近年来随着分子生物学的发展,初步阐明了肝硬变发病机制,从而在基因水平上治疗肝纤维化的研究取得重大进展,现综述如下。

乙肝病毒表面抗原特异性免疫脂质体干扰素的初步研究

免疫脂质体(Immunliposomes)系由脂质体连接特异性抗体制成,集脂质体的特性和抗体的导向性于一体,成为新型药物导向传递系统。本工作应用N-羟基琥珀酰亚胺软脂肪酸为偶联剂,在脂质体双层结构中嵌入了小鼠单克隆抗HBsIgG,制备了具有抗原结合特异性和干扰素抗病毒生物活性的免疫脂质体。 1.材料和方法 1.

腺病毒介导的抗MDR1核酶基因转移联合化疗药物治疗恶性淋巴瘤的研究

目的 探讨腺病毒介导的抗MDR1核酶基因转移在体内外逆转肿瘤细胞中P 糖蛋白(P gp)介导的多重耐药性 (MDR)的作用。方法 构建并纯化制备了含有抗MDR1核酶基因的腺病毒Ad 196MDR1 Rz。在体外 ,用该重组腺病毒转导具有P gp介导的、MDR特性的人淋巴瘤细胞株Daudi MDR2 0 ,并分别用RT PCR、FACS分析和MTT法测定核酶基因转导对Daudi MDR2 0细胞MDR1mRNA和膜表面P gp表达的影响及对长春新碱 (VCR)敏感性的改变 ;在体内 ,通过局部注入重组腺病毒联合VCR全身化疗 ,对接种Daudi MDR2 0细胞的SCID小鼠进行治疗观察。结果 在感染Ad 196MDR1 Rz后 ,Daudi MDR2 0细胞MDR1mRNA的表达被阻断 ,细胞膜表面P gp表达水平显著降低 ,细胞对VCR的敏感性增加。在接种Daudi MDR2 0细胞后 ,采用Ad 196MDR1 Rz联合VCR化疗的治疗组小鼠有6 6 .7% (6 9)未发生肿瘤 ,存活时间超过 12 0d ;而采用空载腺病毒联合VCR化疗或单纯VCR化疗的对照组小鼠 ,其长期存活率分别为 12 .5 % (1 8)和 0 (0 9) ,两组差异有极显著性。结论 Ad 196MDR1 Rz能有效阻断Daudi MDR2 0细胞膜表面P gp表达 ,并恢复肿瘤细胞对VCR的敏感性。体内联合VCR化疗能有效抑制肿瘤的发生。

中国小型猪肝细胞cytodex^(TM)3微载体培养及其功能

目的:研究原代小型猪肝细胞微载体培养方法的建立、肝细胞功能特性及其安全性.方法:将3.20×107个的肝细胞及2g/LcytodexTM3微载体连同40mL含100mL/LHyclone小牛血清及其他附助因子的RPMI1640培养基加入250mL已硅化的方瓶中培养.对不同培养时间的肝细胞进行形态学观察.同时测定不同培养时期肝细胞生物合成及生物转化功能,并对培养上清进行质控实验.结果:肝细胞产量为6.8×109-8.1×109(7.58±0.57)×109/肝;肝细胞活率为92-99%(96±3%);肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征;接种培养后肝细胞呈明显的朝CytodexTM3聚集,二者易相粘贴,黏附在微载体上的肝细胞增生生长较旺盛;当肝细胞数为3.20×107个时,接种后24h肝细胞尿素及白蛋白的合成量分别为1.22mmol/L及0.075g/L;随着时间的延长,利多卡因的转化率逐渐增加,在24h时即达到100%;培养上清需氧、厌氧、真菌培养、支原体检查及热源实验均为阴性.结论:使用微载体培养的小型猪肝细胞具有较旺盛的增生生长能力、良好的生物转化及生物合成功能,同时又是安全可靠的,可作为体外生物人工肝较为理想的细胞来源.

原代小型猪肝细胞的分离培养及其功能

目的:研究原代小型猪肝细胞的分离、培养及肝细胞的形态学变化及其功能特性.方法:用体外灌流装置,DTA和胶原酶两步灌流法消化分离小型猪肝细胞.在含100 ml/L小牛血清及其附助因子的RPMI 1640培养基中培养.对不同培养时间的肝细胞进行形态学观察.同时测定不同培养时期肝细胞生化合成及生物转化功能.结果:(1)肝细胞产量为6.0×109～8.2×109(7.0 × 109±0.79×109)/每只猪肝;(2)肝细胞活率为90.0～99%(94.4±3.07%);(3)肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征;(4)接种培养后肝细胞增生生长旺盛;(5)接种后20 h内每107个肝细胞尿素及白蛋白的合成量分别为1.21～1.50 mmol/L及0.58～0.80 g/L;(6)肝细胞数在1.25×107个～1.60×107个时,利多卡因的转化率在24 h时均在80%以上,随着时间的延长及肝细胞数的增多,利多卡因的转化率逐渐增加.结论:本方法分离获取的肝细胞产率高、活性高、增生生长旺盛、具有良好的生物合成及生物转化功能,可作为生物人工肝较为理想的细胞来源.

干扰素抗体与HBV C基因启动子变异对干扰素疗效的影响

目的 探讨HBVC基因启动子 (BCP)变异的肝炎患者干扰素抗体 (抗 IFN )的产生对干扰素疗效的影响。方法 采用错配PCR RFLP技术检测 89例慢性乙型肝炎血清中BCP变异和血清中抗 IFN的水平。结果 BCP变异率为 5 2 .8%,抗 IFN阳性率为 15 .6 %,而干扰素治疗前抗 IFN阳性与治疗后转为阳性的患者 ,其干扰素治疗的有效率差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,而治疗前后抗 IFN均为阴性者 ,其有效率明显优于阳性者 ,差异显著 (P <0 .0 5 )。在IFN治疗前 ,有BCP变异组抗 IFN阳性 10例 ,野生株组抗 IFN阳性 2例 ,两组相比 ,差异显著 (P <0 .0 5 )。IFN治疗后 ,变异株组出现抗 IFN阳性 4例 ,野生株组出现抗 IFN阳性 1例 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 抗 IFN阳性的患者 ,干扰素治疗效果差。BCP变异的患者 ,在干扰素治疗前 ,有可能促进干扰素抗体的产生 ,但在干扰素治疗后 ,则不增加抗 IFN的产生。

丙型肝炎患者LDL-R等位基因的多态性

丙型肝炎病毒(HCV)感染呈全球分布[1],而我国是丙型肝炎的高发区[2-4].HCV感染者80%发展成为慢性肝炎[5-7],而且发生肝硬变和肝细胞癌的危险性显著提高[8,9].最近证实低密度脂蛋白受 (low density lipoprotein receptor, LDL-R)可以识别和内化与低密度脂蛋白或极低密度脂蛋白结合HCV[10-12],从而确定LDL-R为HCV受体[13-15].LDL-R主要分布于肝实质细胞,能够结合并内化低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL )和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL),利用其中的胆固醇,从而参与胆固醇代谢,并调节血液胆固醇水平[16,17].

慢性乙型肝炎患者体内干扰素产生细胞的初步检测及其临床意义

目的 研究慢性乙型肝炎患者体内干扰素产生细胞 (IPCs)的特点。方法 用流式细胞仪对 2 1例慢性乙型肝炎患者和 12名健康人外周血中IPCs数量的变化进行了检测 ,同时与T淋巴细胞亚群CD4+ /CD8+ 的比值进行了比较分析。结果 慢性乙型肝炎患者外周血IPCs的百分数 ( 0 .0 97± 0 .0 82 )较正常人 ( 0 .310± 0 .0 87)明显降低 ,两者相差3.2倍 ,有显著差异 (P <0 .0 0 1) ,而CD4+ /CD8+ 的比值 ( 1.79± 0 .46 1)则明显高于正常人的 1.39± 0 .396 (P <0 .0 1) ,同时发现在HBVDNA阳性的患者中 ,其IPCs的百分数和CD4+ /CD8+ 的比值分别为 0 .0 83± 0 .0 5 7和 1.98± 0 .5 2 7,均明显高于HBVDNA阴性患者 (分别为 0 .0 42± 0 .0 2 9和 1.47± 0 .46 6 ) ,差异显著 (P <0 .0 1)。结论 与正常人相比 ,慢性乙型肝炎患者外周血中IPCs的数量降低 ,后者可能与慢性乙型肝炎患者病程的进展以及血清中HBVDNA阳性有关 ,确切机制有待进一步研究。

胰腺癌等肿瘤的免疫治疗

胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,早期诊断率和手术切除率均较低,预后差,因此,开展胰腺癌基因免疫治疗研究具有特殊意义,特别是多基因转染胰腺癌形成的特异性胰腺癌瘤苗对胰腺癌的治疗,免疫基因治疗主要是有效地增强机体自身的抗肿瘤作用、清除术后残留肿瘤细胞、修复肿瘤突变基因。目前肿瘤基因治疗常用的策略有:细胞因子导入,肿瘤疫苗制备,自杀基因治疗,利用反义寡核苷酸技术封闭活化癌基因以及向靶组织转移抑癌基因等。现就^(wt)P53、GM-CSF、D7-1对胰腺癌和相关肿瘤的基因免疫治疗作用进行综述。

原代小型猪肝细胞微载体培养及其功能特性

目的 研究原代小型猪肝细胞微载体培养方法的建立及肝细胞功能特性。方法将3.20×107个的肝细胞及2g/L cytodexTM 3微载体连同40ml含100ml/L Hyclone小牛血清及其他辅助因子的RPMI 1640培养基加入250ml已硅化的方瓶中培养。对不同培养时间的肝细胞进行形态学观察。同时测定不同培养时期肝细胞生物合成及生物转化功能。结果肝细胞产量为6.8×109～8.1×109(7.58±0.57)×109/肝细胞;肝细胞活率为92.0%～99.0％(96.25％±3.10％);肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征;接种培养后肝细胞呈明显的朝CytodexTM 3聚集,二者易相粘贴,粘附在微载体上的肝细胞增殖生长旺盛;当肝细胞数为3.20×107个时,接种后24h肝细胞尿素及白蛋白合成量分别为1.22mmol/L及0.075g/L;随着时间的延长,利多卡因的转化率逐渐增加,在24h时即达到100％。结论 使用微载体培养的小型猪肝细胞具有较旺盛的增殖生长能力、良好的生物转化及生物合成功能,可作为体外生物人工肝较为理想的细胞来源。

从保定地区病人血清中扩增出与76-118株同亚型的汉坦病毒核苷酸序列分析

通过对1996年我院收治的肾综合征出血热(HFRS)病人应用 RT-PCR方法进行分型研究发现2例为野鼠型(HTN)汉坦病毒感染。经过对其中一例的病毒部分核苷酸序列的扩增、克隆、序列测定与分析,结果其核苷酸序列与已知HTN型病毒具有较高的同源性,特别是与韩国的76-118株的核苷酸序列极为相似,同源序列占 98.7％,故为同一亚型。

乙型肝炎病毒前S2与α-干扰素融合基因的构建

乙型肝炎病毒前S2(HBV PreS2)基因编码蛋白含55个氨基酸残基,具有聚合人血清白蛋白受体(pHSA-R)活性,是HBV感染嗜肝性的重要机制之一,并在诱导机体产生保护性免疫应答中起重要作用。α-干扰素(IFN-α)是一种多功能免疫调节因子,可诱导机体产生抗病毒蛋白。

逆转录病毒介导核酶基因转移抑制HBV前S2基因表达初探

本文设计合成了针对HBV ayw DNA前S2区第110、122和132位碱基的三靶位串联锤头状核酶基因。经序列分析证明该核酶基因的一级结构与设计序列完全相符。将核酶基因和从含有HBV