紫杉醇生物合成机制研究进展

紫杉醇是目前已发现的最具抗癌活性的天然广谱抗癌药物之一,其生产方式主要依赖于从珍稀植物红豆杉中进行分离提取以及化学半合成,因其含量稀少,生产能力受到严重的限制。随着红豆杉基因组的全解析和合成生物学的迅速发展,通过合成生物技术,构建重组工程细胞合成紫杉醇及其关键前体成为解决当前供需不平衡和资源有限的有效方法。本文针对紫杉醇生物合成途径解析、红豆杉组学分析、底盘细胞构建、关键前体合成、紫杉醇合成途径关键酶的改造及催化机理解析等相关研究进展开展系统性的综述,尤其对近期发表的关于氧杂环丁烷环形成的相关突破性研究进行了详细介绍,并基于相关进展探讨当前紫杉醇合成生物学研究面临的关键酶催化效率低下、产物杂泛性严重、具体反应顺序未知等技术挑战及生物合成紫杉醇关键中间体的未来前景。助力加强对紫杉醇合成通路和催化过程的理解,进一步实现紫杉醇的绿色、高效生物合成。

合成微生物的环境风险防控与检测技术研究进展

合成微生物(基因改造、修饰和重建的微生物)在生物制造、疾病诊疗、环境修复等领域展现出巨大应用潜力。与此同时,合成微生物的规模化应用可能存在环境生物安全风险问题,造成物种入侵、多样性丧失和生态系统破坏等不可预计的后果。为此,本文总结了合成微生物环境释放后潜在的生物安全风险,围绕合成生物学建立的环境防御与检测技术展开讨论,并对未来如何更好地避免工程微生物的环境风险问题提出展望。经梳理发现:①合成微生物释放引发的环境风险主要包括危害环境生物安全、水平基因转移及生态位占据和破坏等,这主要与合成微生物改造后的特性及携带的外源片段有关。②通过营养缺陷型或环境敏感型微生物、基因线路、使用非天然元件、限制质粒异源复制等技术可避免合成微生物在环境中的存活或核酸扩散,针对不同微生物的特性可采取相应策略。③分子标记、生物传感、快速核酸检测等针对合成微生物的特异性检测方法,以及微生物条形码与高通量测序等通用性检测技术可用于合成微生物的环境追踪。鉴于此,提出今后重点研究方向:一是升级高效、稳定型生物封存策略以应对微生物的快速进化;二是分析合成微生物的环境生存能力及分级预估其潜在风险;三是研究合成微生物与环境生物的互作机制及其对环境生物的影响;四是开发环境消减技术建立以确保合成微生物失控释放后的高效清除。

液滴微流控技术在微生物工程菌株选育中的应用进展

微生物工程菌株是生物制造的重要基础,但大多数的工程菌株需要进化改造才能适用于生物制造。在菌种选育过程中,如何高效地筛选获得具有目标性状的微生物工程菌株是进行生物制造应用的关键影响因素之一。液滴微流控技术作为近年来发展起来的一种基于微芯片的高通量检测筛选技术,可以生成大小均一、相互独立的微体积液滴小室,并应用于单细胞的培养、检测和分离,在微生物菌株改造尤其是分泌型菌株的改造中得到广泛应用。本文首先概述液滴微流控技术的组成部分,对关键性的技术进行简要介绍;其次根据液滴检测信号的来源、液滴筛选流程的难易程度和液滴分选仪器的适用范围,对液滴微流控技术在工程菌株选育中的应用进行总结分析;最后对液滴微流控技术在应用中存在的问题和研究方向进行展望,为深化其在微生物合成生物学中的应用提供指导。

电能辅助二氧化碳生物转化

CO_(2)排放带来全球性气候变化问题,为此世界各国纷纷采取了一系列减排固碳措施。我国于2020年提出“碳达峰,碳中和”发展目标,推进固碳技术发展迫在眉睫。受益于近年来合成生物学领域的迅猛发展,基于酶或微生物催化的CO_(2)生物转化研究在酶元件、途径和系统的人工设计改造等方面取得一系列重要进展,典型产物代表有燃料、氨基酸、淀粉、单细胞蛋白、生物塑料及其他多种生化产品。为此,CO_(2)也被认为是第三代生物原料。CO_(2)转化的关键在于外加能量活化CO_(2)分子,相比于光能、热能和化学能等,电能在成本投入和小型便捷方面优势突出,因此更受科学界和产业界青睐。CO_(2)生物转化利用电能分为两种方式,即生物直接利用电能固定CO_(2)和利用电能间接辅助CO_(2)生物转化[包括电催化CO_(2)还原、电再生辅因子(如NADH)、电解水制氢]。本文全面介绍了这两种方法在CO_(2)生物转化方面的研究进展,分析了可能的固碳机制,并讨论了不同方法的优点和缺点。此外,还提出了合成生物技术应对低效CO_(2)生物转化时的可能策略如挖掘高活性固碳酶、酶工程改造提高酶与电极之间的电子传递效率、代谢工程改造丰富固碳微生物的产物种类和提高固碳效率等,以期相关研究能真正走向实际应用,助力我国双碳目标的实现。

多基因同步调控结合高通量筛选构建高产L-苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株

L-苯丙氨酸(L-Phe)是重要的食品及医药中间体,但由于其生物合成途径较长且调控机制复杂,仅依靠质粒或者周期漫长的基因组逐轮改造,难以实现各个模块之间的通量平衡,在一定程度上限制了其产量的进一步提升。本研究将L-Phe生物合成途径中的7个携带组成型启动子PF11及核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)为GGGGGGGG的关键基因ppsA、tktA、aroF^(fbr)、aroE、aroL、pheA^(fbr)和tyrB,整合到谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因组中;利用课题组前期研发的基于CRISPR/Cas系统和胞苷脱氨酶的无模板基因表达调控技术(base editor-targeted and template-free expression regulation,BETTER),对每个关键基因的RBS进行同步编辑,生成富含G/A的RBS突变文库;利用前期开发的荧光蛋白型L-Phe生物传感器结合液滴微流控系统(droplet microfluidics)对RBS突变文库进行高通量筛选。最终,从大约7万个RBS突变文库中筛选到4株L-Phe产量提升不同程度的突变菌株,其72 h摇瓶发酵产量分别为2.06、1.30、4.42和7.44 mmol/L,相比对照菌株C.g-2(0.6 mmol/L)分别提高了2.43、1.17、6.37、11.40倍。利用碱基编辑器同时调节多基因的表达水平并筛选组合文库,可以为L-Phe工程育种提供一种可行策略。

代谢工程改造大肠杆菌生产氢咕啉酸

维生素B_(12)是唯一含有金属离子的维生素,其合成途径尤为复杂。大肠杆菌工程菌是生成维生素B_(12)的新菌种。氢咕啉酸作为维生素B_(12)合成途径重要的稳定中间体,通过代谢工程提高大肠杆菌氢咕啉酸的产量具有重要意义。经过不同宿主的对比发现BW25113(DE3)是生产氢咕啉酸的合适宿主。利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术将氢咕啉酸生物合成基因在染色体上表达,氢咕啉酸产量提高12倍,达到6.38 mg/L。增加前体尿卟啉原Ⅲ供应,氢咕啉酸产量再次提高,达到11.61 mg/L。敲除ackA-pta对氢咕啉酸产量提高没有效果。经过引入运动发酵假单胞菌来源的Entner-Doudoroff途径提高还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)水平,1株无抗菌株的氢咕啉酸产量提高到14.60 mg/L。该研究为大肠杆菌高效生产维生素B_(12)奠定了基础。

原儿茶酸脱羧关键酶挖掘改造优化儿茶酚生物合成

儿茶酚(catechol,CA)是一种重要的化工和医药中间体,应用范围极为广泛。目前制备CA的方法是苯酚羟化法,但由于该方法存在对环境污染大、石化资源不可再生等问题,使得生物合成儿茶酚的方法逐渐受到关注。但受制于原儿茶酸脱羧酶的活性不够高且生物合成儿茶酚生产效率较低,难以满足大规模工业生产的要求。为了进一步提高儿茶酚生产效率,本研究首先对不同来源的21个原儿茶酸(protocatechuic acid,PCA)脱羧酶进行筛选,发现理研菌(Rikenellaceae)来源的RbAroY脱羧酶性能最好,含有该酶的全细胞生物催化剂ER11能够合成13.54 g/L儿茶酚。然后利用在线工具HotSpotWizard对该酶进行稳定性计算,选取自由能下降最多的10个潜在突变位点进行验证,发现含有突变子RbAroYG99A的全细胞生物催化剂ERT01能够催化合成15.16 g/L儿茶酚,较野生型产量提高12%。之后对生物催化条件进一步优化,以原儿茶酸为底物,全细胞生物催化剂ERT01能够催化合成25.70 g/L儿茶酚。最后,以3-脱氢莽草酸发酵液为底物,同时表达3-脱氢莽草酸脱水酶和原儿茶酸脱羧酶的全细胞生物催化剂DER03,催化合成29.55 g/L儿茶酚,为目前国内外报道的生物合成的最高产量。本研究为儿茶酚生物合成工业生产提供了重要参考。

嗜热毁丝霉果胶酯酶MtCE12-1的克隆表达及其酶学性质和应用研究

【目的】挖潜新型果胶酯酶的酶资源,在嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)中高水平表达烟草生物质诱导显著上调的同源果胶酯酶,对其进行酶学性质研究,并探究该果胶酯酶在协同降解烟草生物质过程中的作用。【方法】利用RTqPCR的方法分析嗜热毁丝霉在烟草生物质中果胶酯酶MtCE12-1的表达水平,通过2A肽介导的表达筛选系统,在嗜热毁丝霉菌株ATCC 42462中高表达果胶酯酶基因Mtce12-1,对高活性的阳性转化子进行产酶培养和蛋白纯化,表征了果胶酯酶MtCE12-1的酶学性质;以两种烟草生物质烟草压棒和烟草梗丝为底物,通过检测纤维素的剩余含量,分析了与纤维素酶的协同作用效果。【结果】与葡萄糖培养条件相比较,烟草生物质条件下果胶酯酶基因Mtce12-1的转录水平显著上调109-110倍,SDS-PAGE电泳分析、拷贝数和Western检测显示,重组蛋白MtCE12-1成功进行了表达和分泌,表达水平达到464.08 U/mL。该酶在75℃、pH 8.0时表现出最佳酶活力,在50-85℃和pH 7.0-9.0的范围内表现出较好的酶活力,具有良好的热稳定性。将100-300μg的MtCE12-1添加至降解体系后,烟草生物质中纤维素降解效率分别提高了18.5%-30.7%和14.6%-30.5%。【结论】用2A肽介导的表达系统在嗜热毁丝霉中可以高效表达和纯化制备目标蛋白,碱性果胶酯酶MtCE12-1不仅具有良好的温度稳定性,在烟草生物质降解过程中也具有突出的作用效果,为烟草工业生产应用提供了潜在的优质酶资源。

1,3-丙二醇的微生物合成:C6-C3-C1原料体系的转变

1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PDO)是一种具有广泛应用价值的二元醇化合物,可用于制造多种医药中间体、食品和化妆品,也是合成纤维材料聚对苯二甲酸丙二醇酯的关键单体。微生物转化葡萄糖等可再生原料合成1,3-PDO因具有环境友好、高效节能、安全可持续等优点,已实现产业化,是微生物化学品工厂设计与应用的成功案例。但是,粮食紧缺和气候变化等问题正在推动化学品生物制造的原料朝着非粮化、低成本、可持续的方向转变。微生物转化C3原料甘油合成1,3-PDO的研究已较为深入。近年来,以能量密度更高的甲醇等C1原料合成1,3-PDO也受到广泛关注,多条新的人工合成途径被创建并成功验证,为1,3-PDO可持续生物合成奠定了基础。本文重点从C6-C3-C1原料体系转变的角度综述了1,3-PDO的微生物合成研究进展,对不同原料体系下提升1,3-PDO合成效率的代谢途径改造策略进行了讨论,并对C1原料合成1,3-PDO的发展前景进行了展望。

糖磷酸酶的挖掘及其酶学性质研究

【目的】在以淀粉或糊精为底物合成具有高附加值的单糖的多酶级联反应中,利用糖磷酸酶催化发生不可逆的脱磷反应可以高效拉动整个反应朝产物生成的方向进行。本研究旨在挖掘新的糖磷酸酶并对酶学性质进行鉴定。【方法】通过基因挖掘的手段筛选得到一种来源于嗜热菌Thermoproteus sp.CIS_19的未知功能的基因TsPase具有糖磷酸酶活性,在E.coli BL21(DE3)中实现异源可溶性表达及纯化,进一步对其酶学性质进行表征。【结果】最终确定糖磷酸酶TsPase的最适反应温度是70℃,T_(m)值为(80.3±1.3)℃,最适反应pH为4,金属离子Mg^(2+)对TsPase有较强的促进作用。针对底物为塔格糖6磷酸盐的动力学常数K_(m)为(2.40±0.98)mmol/L,催化常数k_(cat)为(102.50±8.60)min^(-1)。将TsPase应用于体外多酶合成体系中,以10 g/L麦芽糊精为底物,一锅法生产D-塔格糖,反应平衡体系中D-塔格糖产量为(4.26±0.03)g/L,转化率可达42.6%±0.3%。【结论】TsPase不仅具有较好的热稳定性和活性,在体外多酶合成体系中也具有优势,这些特征在以后的理论研究及工业生产中具有一定的科学价值。

甲醛对甲醛裂合酶结构的修饰作用研究

为了探究甲醛对甲醛裂合酶的影响及导致该酶失活的原因,将甲醛裂合酶与不同浓度甲醛溶液(300 mmol/L和1 mol/L)孵育不同时间(1 h、2 h和3 h)后检测该酶的活性,再将孵育后的甲醛裂合酶进行液相色谱–串联质谱(LCMS/MS)检测,分析甲醛对该酶的修饰/交联位点。结果表明:在甲醛溶液中孵育后的甲醛裂合酶存在明显的交联和结构修饰现象,且甲醛浓度越高孵育时间越长,酶的交联程度越高;使用LC-MS/MS分析确定了甲醛裂合酶N186、K228两个甲醛修饰位点以及潜在的甲醛交联片段。甲醛分子通过与天冬酰胺、赖氨酸等氨基酸发生交联反应,破坏其局部结构并改变整体的聚集状态,从而使其失活。本研究为提高甲醛裂合酶的甲醛耐受性提供了潜在半理性设计的改造位点和思路。

生物塑料聚(己二酸丁二酸二丁酯-2,5-呋喃二羧酸丁二醇酯)前体的酶催化合成

【目的】聚(己二酸丁二酸二丁酯-2,5-呋喃二羧酸丁二醇酯)[poly(butylene adipate-co-butylene 2,5-furandicarboxylate),PBAF]是一种可生物降解的呋喃基共聚酯塑料。化学合成PBAF的过程中,寡聚片段聚合的随机性会生成嵌段共聚物、无规共聚物、交替共聚物等多种复杂聚合物,从而影响生物塑料PBAF的质量。本研究以单体2,5-呋喃二甲酸二甲酯(dimethyl furan-2,5-dicarboxylate,FDME)和1,4-丁二醇(1,4-butanediol,BDO)为底物,通过酶促反应合成双(4-羟基丁基)呋喃-2,5-二羧酸酯(bis-BDO ester),为生物塑料PBAF提供可以进行可控聚合反应的生物塑料前体,从而减少副产物生成的问题。【方法】在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中异源表达来源于嗜橡胶根瘤杆菌(Rhizobacter gummiphilus)的RgPETase,发现RgPETase对底物FDME和BDO具有一定的酰基转移酶活性。深入研究了合成双(4-羟基丁基)呋喃-2,5-二羧酸酯的反应条件的优化,包括反应pH、反应温度、底物兼溶剂BDO的含量和反应酶量。【结果】RgPETase的最适反应pH值为8.0,底物兼溶剂BDO的最适含量为30%,最适反应温度区间为25-30℃。在最适条件下,即反应温度为30℃且酶浓度为6µmol/L时,RgPETase催化10 mmol/L FDME可产生(2.96±0.01)mmol/L双(4-羟基丁基)呋喃-2,5-二羧酸酯。【结论】RgPETase具有较好的酰基转移酶活性,能通过酰基转移反应有效催化FDME生成双(4-羟基丁基)呋喃-2,5-二羧酸酯,为生物塑料PBAF前体的合成提供了一条绿色可持续的途径。

食品技术的历史回顾与未来展望(五)

第四次农业革命.现代农业逐渐暴露了其局限性,它导致化肥、农药、除草剂的大量使用和土壤退化。20世纪90年代初,又发现用现代农业技术种植的高产谷物中矿物质和维生素含量很低,用作粮食常因维生素和矿物质营养不良而削弱了人们抵御传染病和从事劳动的能力,最终可能使一个国家的劳动生产率降低,经济的持续发展受阻。

食品技术的历史回顾与未来展望(四)

墨西哥从1960年推广布劳格的矮秆小麦,短短3年间达到了种植面积的35%,总产接近200万吨,比1944年提高5倍,开始部分出口。1966年,印度实施绿色革命发展战略,从墨西哥引进高产小麦品种,同时增加了化肥、灌溉、农机等投入。到1980年,印度粮食总产量增加2倍,由粮食进口国变为出口国。绿色革命的成就是史无前例的,在推广绿色革命的11个国家中。

用颠覆性技术端牢中国饭碗

我国粮食现状喜中有忧我国粮食安全正受到一定威胁。总体而言,需求刚性增长,资源约束趋紧。国产小麦、稻谷作为口粮,可确保绝对安全,但是大豆必须要进口,玉米作为工业淀粉来源和饲料也需要进口。同时,消费结构升级,我国谷物需求预计2030年前后将达到峰值。

人类食品技术的历史回顾与未来展望(一)

“民以食为天”源自司马迁著的《史记·丽生陆贾列传》:“王者以民人为天,而民人以食为天。”人民以粮食为生活根本,人民群众需要生产粮食等生活必需品来维持生存。《尚书·洪范》所列举的治理国家的八个方面,称“八政”,就把“食”列在第一,而其他诸如军事等都排在后面。粮食是人民生存的首要问题,粮食安全不仅关系到人民群众的身体健康和生命安全,也关系到经济发展、社会稳定以及国家和政府的形象。“世界粮食日”是世界各国政府在每年10月16日围绕发展粮食和农业生产举行纪念活动的日子。

人类食品技术的历史回顾与未来展望(二)

第一次农业革命——新石器革命第一次农业革命大约发生于1万年前,从采集野生小麦、粟和水稻的种子,发展为有意识的栽种,从游牧逐步到半定居等待收获的农耕生活方式。新石器革命是指人类发明了农业和畜牧业,人类由旧石器之寄生者变成新石器之生产者,开始制造和使用磨制石器和陶器。农业的产生是人类历史上的一次巨大革命,人类由食物的采集者变为了食物的生产者,生产力大大提高。

人类食品技术的历史回顾与未来展望(三)

第三次农业革命一一现代农业和绿色革命19世纪90年代的农业“机械革命”,出现了以内燃机为动力的拖拉机,20世纪初的农业“化学革命”(工业合成氨、农药、除草剂等)以及20世纪前半期的农业“杂交育种革命”,导致粮食产量革命性地大增长。现代农业打破了“马尔萨斯定律”,简单来说,人世间的一切灾难都是几何级数增长的人口与算术级数增长的生活资料在均衡过程中的产物,人类的发展也必然始终与灾难相伴。在整个20世纪,全世界粮食价格大约以每年1%的速度持续下降。在20世纪下半叶,绝大多数发达国家都获得了稳定的食物供应。

甲醇芽孢杆菌:下一代工业生物技术的新型底盘

甲醇是绿色生物制造的新一代非粮可再生原料,具有来源丰富、价格低廉、能量密度高等优势.甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)是一种革兰氏阳性、嗜热的兼性甲基营养细菌,通过烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)依赖型甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase,Mdh)和核酮糖单磷酸循环(ribulose monophosphate,RuMP)同化甲醇,能够在50℃~55℃条件下利用甲醇快速生长并合成包括L-谷氨酸和L-赖氨酸在内的多种高附加值产品,是下一代工业生物技术的新型底盘.B.methanolicus模式菌株MGA3的基因组、转录组、蛋白组和代谢组等组学信息已被解析,为了解其遗传代谢特征,进行代谢工程改造奠定基础.但是,相比于大肠杆菌等模式微生物底盘,B.methanolicus的基因编辑和调控使能技术较为落后.本文总结了B.methanolicus的遗传和生理特征、可用的基因表达元件和工具,以及生物合成应用进展,讨论亟需突破的研究方向,展望了B.methanolicus在工业生物技术中的应用前景.

食品技术的历史回顾与未来展望(六)

为解决蛋白质的新来源,1960年科学家们就开始通过培养单细胞生物来获得微生物蛋白质,即单细胞蛋白(SCP)。单细胞蛋白具有以下优点:(1)生产速度快,因为微生物的生长繁殖速率快;(2)生产效率高;(3)生产原料来源广.